中药复方药效物质基础研究方法探讨

杨炳烈付天灵

（1 内蒙赤峰65655部队医院，内蒙 赤峰 024000；2 内蒙赤峰红山中医院，内蒙 赤峰 024000）

中药复方药效物质基础研究方法探讨

杨炳烈1付天灵2

（1 内蒙赤峰65655部队医院，内蒙 赤峰 024000；2 内蒙赤峰红山中医院，内蒙 赤峰 024000）

中药复方药效物质基础研究为中医药研究领域的重点及难点，近年来许多专家学者对此进行了大量研究与实践。本文回顾分析了近十年来有关中药复方药效物质基础研究的相关文献，对中药复方药效物质基础研究所采用的新技术、新方法和研究中存在的问题进行综述与探讨。

中药复方；药效物质基础；综述

中药复方是中医临床用药的主要形式，其独特的疗效和复杂性等成为中医药研究领域的热点和难点。长期以来，对方剂发挥临床疗效实质的阐明多以中医药理论来解释，未能从微观层次上说明其发挥药药效的物质基础及原理，难以被国际社会所接受及应用[1]。因此，中药复方药效物质基础的发现与辨析，一直是中医药基础研究与新药研发的关键[2]。中药的复杂性决定了它多成分、多靶点、整合调节的优势和特色，同时机体整体调控的复杂性也存在一个逐渐被认识、被解析的过程。正是由于中药成分和机体调控的复杂性，中药的药效物质、作用环节以及物质配伍关系的阐明也是当前药学研究工作的巨大挑战。中药复方药效物质基础研究传统使用的方法主要为拆方研究法[3-5]和整方研究法[6-8]，并取得了一定进展。随着科学技术的发展，近年来一些新方法逐渐应用于复方效应物质基础研究之中。本文对该领域的十年来研究现状进行了综述，并对其发展进行展望。

1 代谢研究法

口服的中药复方成分在消化道内，一些成分经相应的肠内菌群作用代谢转化后被吸收，另一些成分则以原型被吸收；吸收后的成分在肝脏解毒后经胆汁排泄，与肠内菌接触发生结合、裂解等代谢转化后再次被吸收；还有些成分不被胃肠吸收而直接被排泄掉[9]。代谢研究法的思路之一是用整体动物进行代谢研究，即通过给药后对动物血液、尿、胆汁、胃液、肠液、粪便等进行分析、分离，从而发现复方在体内真正发挥药效的物质，进而研究物质基础和复方作用机制[10]；思路之二是在体外模拟体内条件进行代谢研究，即通过分析复方在人工胃液、肠液及肠道菌丛中可吸收成分及其转化特征，结合药效学的结果分离中药复方有效成分[11]。最近，越来越多的研究显示，许多复方中的天然成分经过肠道菌代谢后才具有生物活性，而代谢研究法可以有效地排除大量的无效成分的干扰从而更加快速的发现真正起作用的有效成分。例如，对人体服用小柴胡汤后血浆的研究发现了原方中没有的一些新化合物，如黄芩苷的新代谢物黄芩苷元6-O-硫酸酯等[12]；对参附汤体内代谢的化学成分进行的研究发现，大鼠口服参附汤后，乌头类生物碱卡米查林、塔拉胺、附子灵以原型形式被吸收，而人参皂苷则是经肠内细菌代谢后以代谢产物Compound K形式吸收进入体内，且均通过尿液排出体外[13]。

2 血清药理学和血清药物化学方法

中药血清药理学和血清药物化学认为，中药复方成分虽然复杂，但进入体内且被检测到的化学成分的数量是有限的[10]。进入血液的成分构成血清“粗提物”，包含复方制剂的原型单体、加工炮制和煎煮过程产生的产物、肠内菌代谢产物，以及它们对机体直接作用后产生的生理活性物质[14]。运用血清药理学和血清药物化学研究方法研究复方物质基础取得了许多有价值的研究成果。最近，对冠心II号含药血清进行HPLC分析，发现该制剂的血清成分谱数目有限：从给药动物血清中只测出川芎嗪、阿魏酸、丹参素、原儿茶醛、芍药苷等9种成分[15]；对茵陈蒿及其复方进行的血清药物化学研究发现：口服给药后，具有促进胆汁分泌作用的6，7-dimethylesculetin （6，7-DME）被大量吸收入血（生物利用度为62.4%），其他药物成分可能在其他环节对6，7-DME产生影响，但在血液中并未检出，由此认定6，7-DME为茵陈蒿及茵陈蒿汤的效应物质基础[14]。血清药理学和血清药物化学的研究结果，不仅可阐释药效物质基础，还可通过各种适宜的方法（化学合成、水解、酶解及细菌代谢等）制备活性成分，进而参考血清有效成分的比例和浓度，配制新的中药制剂。

血清药理学和血清药物化学研究方法，排除了复方制剂及其粗提物本身复杂的理化性质（如各种电解质、鞣质、pH值、渗透压等）的干扰，排除了胃肠中不能进入血清的药物成分，使中药复方效应物质基础问题得到简化[9]；含药血清包含了复方真正的有效成分，避免了复方及其粗提物体外实验中诸多因素的影响，能较准确、真实地反映复方的药效、作用机制及药代动力学。然而，该法在实际运用中也遇到了很多问题。不可否认，在血清中检测到的“成分”可能是无效物质或是有效物质的代谢产物；而且，某些吸收入血检测到的成分，经过富集和提纯后，需加到比原来血清中的浓度高许多倍时才显示相关药理作用[16]，这给有效成分的确定带来困难。此外，不同种属、年龄的动物对药物吸收的差异，不同给药剂量、采血时间造成的血药成分、浓度的差异，加上血清内源性成分的干扰，给血清有效成分的分离鉴定造成了相当大的困难[11]。因此，我们认为中药血清药理学和血清药物化学虽是一种很有发展前途的方法，但许多问题尚待今后系统深入的探讨。

3 黑箱分析法

“黑箱分析法”采用反向思维模式，不再把研究的重心放在分离、纯化各种有效成分上，而是通过研究服药后机体受到影响而出现的新的效应分子（蛋白质），来确定最终起治疗作用的物质[17]。该法是通过分析单味药及复方的化学成分（输入）和血清或病变组织器官中与疗效相关的效应成分（输出）的关系，找出复方的物质基础[18]。实际操作中，先获得复方全成分化学信息，再利用计算机将复方成分与药理实验数据特别是蛋白质等效应分子的结构和功能进行相关，并对单味药和各种不同配伍复方化学成分进行比较和归纳，寻找化学成分与活性的关系规律，从而阐明复方的作用物质基础。与其他技术结合运用，黑箱分析法取得了良好效果。肖红斌等在中药复方全成分黑箱分析基本思路的基础上，运用智能多模式多柱色谱系统（MMCC）及其联用技术探讨了当归补血汤效应物质基础[19]。与其他方法相比，黑箱分析法忽视了组成复方的各单味药之间的相互配伍和平衡关系。尽管如此，该法独到的研究思路在复方效应基础研究中将发挥应有的作用[18]。

4 分子生物色谱技术

与传统的色谱技术利用分子间的物理作用分离化合物不同，该技术是基于生物大分子的特异性识别和相互作用来分离和测定活性化合物，在中药特别是复方活性成分的分离鉴定中具有广泛用途[20]。其操作过程是将生物体内活性物质（如酶、受体、运输蛋白和其他具有重要生理功能的生物大分子）固定于色谱填料中，中药复方提取物经过色谱柱后，经过特异识别、结合和分离，最终被分离鉴定[11]。如，将以人血清白蛋白为配基的生物色谱筛选方法运用于Artemisia capillaris Thunb.有效成分的研究，获得了有生物活性的有效成分scoparone和capillarisin[21]。分子生物色谱中药物在柱上的保留行为直接与活性相关，对生理学和药理学研究具有特别意义。分子生物色谱不仅可研究复方效应物质基础，还有助于阐释药物的分布、排泄、代谢、活性、毒副及体内生物转化。如，将肝微粒体固载于色谱担体上，可研究中药成分在生物体内可能发生的生物转化。由于分子生物色谱可用粗提液直接进样，简便快速，重现性好，在中药复方物质基础研究中具有巨大的应用潜力[22]。

5 中药组合化学技术

该方法是在组合化学技术的启发下提出的，即以中药复方天然组合化学库的多靶作用机制为依据，在中医药理论的指导下，采用反映方剂主治病证的药理学指标，通过组分或单体成分的组合筛选，找出其活性最强的有效组分构件[23]。中药复方成分是由多种结构类型的组合化学库组成的分子库。许多植物药已能分离鉴定出100种左右的化学成分，因此，一个由4～5味中药组成的复方，就可能含有500种左右的化学成分，包括有效成分和无效成分，而且在加工炮制过程中可能产生新的成分[24]。不同种属的植物（药材）中成分的结构类型有其特征，但有类似性和规律性，如“黄酮结构类型”、“三萜结构类型”、“吲哚生物碱结构类型”等。通过初步的化合物类型的分离，可用生物活性筛选的手段直接从个别库中“钓”出有活性的化合物（如用有荧光标志的化合物受体从库中“钓”取能与之结合的化合物），或通过类似于亲和层析的方法直接从库中吸附有相互作用的化合物，再分别测定各类化合物的结构和生物活性，经过分析和归纳，最终阐明复方作用物质基础[3]。有人采用二元索引库筛选法对川芎、天麻提取物的复方组合化学进行了探索研究，结合血清药理学方法，找出了活性最强的两组构件，即川芎醇提物+天麻醇提物是组合复方抗血小板释放5-HF作用和阻滞血管内皮细胞钙通道作用的基本构件。中药复方的组合化学研究，体现了复方多组分协同的特点，简化了方剂的分子多样性，具有很强的操作性，简便、快速、高效。

6 多靶点筛选与中药生物芯片技术

多靶点筛选的方法就是针对中药复方多成分调节作用的多靶点特性，通过配体-受体的药物研究理论，进行药效物质作用靶点分析或有效成分的筛选、确定。这是一个从深层次揭示复方效应物质基础及作用机制的研究思路。需要指出的是，中药复方配伍的作用靶点极其复杂，特别是其有效成分并不一定是与受体结合，有可能通过改变“环境”或一个成分影响另一个成分对受体的作用等形式影响受体的功能[25]，这给有效成分的研究带来相当大的困难。令人欣慰的是由于近年来生物芯片技术的发展，以基因、受体、酶等为药物作用靶点的高通量筛选技术，在中药有效成分筛选、分离、发现等的研究中将发挥更大作用。

近些年生物芯片技术的发展和应用为中药研究提供了新的手段，特别是生物芯片技术高通量、多因素、微型化和自动化的特点，给中药复方分析带来了极大的便利[26]。生物芯片技术可以把复杂的混合化学物质分为几类，使得筛选工作更加简便，如根据中药不同化学成分的分离条件，可设计不同成分（如生物碱、醌类、黄酮、皂苷等）提取、分离、鉴定的分析用生物芯片；也可设计同时分离各种成分的综合分析用生物芯片，用于单味药成分筛选性分析，复方归类分析等；还可针对某味药材的多种组分设计用于该药材分析和鉴定的中药材芯片[27]。目前，国内已有人利用基因芯片对中药复方—黄连解毒汤进行了尝试性研究[28]。特别指出的是，以生物芯片技术为基础的多靶点高通量筛选技术在中药有效成分研究中潜力巨大。

7 数据库与计算机技术相结合

周家驹等[29，30]对中药传统功效、有效成分及现代药理学研究等资料进行整合，建立起一套中草药化学资料的辨识和分析规范，并据此研制了中药化学数据库（Traditional Chinese Medicine Database，TCMD），TCMD可提供中草药所含成分化学结构、理化性质、生物活性、药理活性以及文献来源等信息，大大提高了中药复方研究效率，是研究中药复方的有用工具。中国科学院联合软件开发在MDL化学信息管理系统基础上建立了中国天然产物数据库（CNPDTM），为中国的新药、天然产物及中药复方等相关研究提供了天然产物、生物活性数据、原植物来源及中药传统应用融为一体的信息。现已用于虚拟筛选方法发现活性化合物的研究[31]。徐筱杰等[39]建立了用于中药复方研究的计算机系统，该系统包括中草药成分三维结构数据库、受体三维结构数据库、代谢库、具有生物活性数据的化合物数据库为核心的知识库系统；以分子对接为核心的分子间相互作用计算机模块；以三维定量构-效关系（3D-QSAR）为核心的构-效关系及分子相似性研究单元等计算模块。该系统对于研究复方组分间相互作用，复方成分及可能形成复合物的三维结构，确定复方有效成分及其中药组分在体内的代谢研究提供了大量数据信息，有助于中药复方物质组成和作用机制研究。

8 分子烙印技术分离中药复方有效部位

分子烙印技术是根据特定目标分子（即模板分子）制备具有高度亲和性聚合物材料（MIP）的技术。MIP存在与模板分子空间结构互补，功能团相互作用（氢键、离子或范德华力等）的聚合物孔穴。MIP与模板分子的作用类似于酶和底物的结合，对模板分子具有较强亲和性及识别能力。目前，MIP作为固相提取材料从中药复方中分离有效部位尚属新颖。谢建春等[33]尝试以丙烯酰胺作为功能单体，以槲皮素为模板，在极性溶剂中，用非共价键法制备了MIP。结果表明，MIP对槲皮素具有特异亲和性，将该MIP直接分离银杏叶提取物水溶液，得到主要含模板槲皮素及其结构类似化合物山奈酚两种黄酮类组分。利用MIP特异亲和性从中药复方中提取、分离具有相同空间结构、相似功能团的有效部位，将会成为中药复方有效部位提取、分离的有效手段。

9 小结与展望

近年来，中医药研究者对中药复方的药效物质基础进行了大量研究，已经取得了一定的成绩，但是中药复方药效物质基础的研究仍存在以下问题：由于中药复方组方的复杂性，研究者对其药效物质基础的认识还难以统一，加之有效成分含量低微，使其在体内外难以检测；此外，中药复方是在整体观念指导下的一个药效物质整体，目前研究所采用的只对其中一至两个成分进行定性定量检测与评价，难以反映中药复方药效物质的整体；中药复方是在中医药理论指导下，以辨证论治为原则，因证组方，但在动物实验研究中，证的模型相对于疾病模型欠成熟，缺乏较系统的研究。尽管由于中药复方化学成分的复杂性使得中药复方药效物质基础的研究困难重重，但近年来多学科的互动与交融，新技术、新方法的出现及在中医药研究领域的广泛应用，为复方的研究发展带来了新的思路和发展。特别是随着中药血清药理学和血清药物化学研究方法的进一步成熟，结合中药组合化学检测方法及手段的进一步发展，在不久的将来中药复方药效物质基础的阐明将逐渐变为可能。

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