皮肤抗氧化功效评价动物模型及替代方法

步 犁，程树军，秦 瑶，谈伟君

(1.广东药学院公共卫生学院，广州 5103101;2.广东检验检疫技术中心，广州 510623)

皮肤是各种理化因素损伤的重要靶组织，如紫外线与环境污染物的不良影响可能造成皮肤结构和功能的损伤。越来越多的证据表明皮肤氧化与抗氧化稳态的失衡与皮肤老化、干燥、色素沉着等直接相关，而过敏性皮炎、色斑形成等严重皮肤病变也与氧化损伤密切相关［1］。近年来，有关皮肤氧化损伤与防护的概念已深入人心，各种宣称具有抗氧化功效的皮肤护理产品深受消费者欢迎，开发抗氧化植物提取物和活性配方成为产品研发的热点。因此如何在传统动物模式的基础上，建立更加快速、有效而且与人体皮肤相关性更高的检测方法非常重要。

1 皮肤氧化应激原与检测指标

氧化损伤主要通过内源性和外源性两方面产生，造成氧化损伤的主要物质是活性氧族(ROS)。内源性ROS主要来源于有氧氧化的副产品和细胞炎症反应。外源性ROS主要来源于紫外线辐射和环境污染物的刺激，由于人类生存环境的恶化和化合物不合理利用，使得皮肤接触各种污染物的机率比以往增加，重金属、颗粒物、紫外线照射、电磁辐射、化学有机试剂等远远超出其环境本底浓度，这些污染物与人体皮肤接触，除了本身就是氧化剂或具有氧化活性外，有的可催化和加速氧化应激的生物学过程。

目前用于研究皮肤氧化应激的最多因素是紫外线，包括UVA和UVB，UVB照射主要引起表皮细胞DNA损伤，蛋白质氧化和诱导基质金属蛋白酶(MMPs)活性，UVA照射则引起真皮层细胞的损伤，与皮肤弹性丧失和光老化相关。两种波长的紫外线均能诱发ROS的产生，进而引起皮肤的深层次伤害［2］。近年来，植物源性抗氧化剂之所以引起关注，主要原因与其能清除ROS和抑制UV诱导的信号传导通路的作用有关。许多研究表明化妆品中合理添加抗氧化剂，或在皮肤疾病治疗中使用含抗氧化成份的产品可有效阻止紫外线介导的皮肤损伤。

多种模拟人体皮肤环境生态暴露的危害因子成为新的研究对象，例如大气污染物、有害气体等。研究发现光化学烟雾中的臭氧是重要的皮肤氧化应激源，它可攻击皮脂和细胞膜脂中的多不饱和脂肪酸，诱发产生的醛、羟基过氧化物和自由基可造成皮肤功能受损［3］。

皮肤组织中促氧化过程和抗氧化防御系统的失衡造成了细胞内氧化还原反应稳态的紊乱，最终导致皮肤氧化应激和损伤的后果。因此，氧化产生的自由基，以及受自由基攻击的靶点及其变化是检测的主要指标。这些指标包括:细胞DNA突变或表达衰老蛋白增加，细胞毒性作用通路的级联反应，多种细胞器的直接损伤，内质网应激和线粒体应激等。另一方面，正常皮肤防御体系的消长也是常用检测指标，包括抗氧化酶类(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶)、蛋白性抗氧化剂(谷胱甘肽、铜蓝蛋白、金属硫蛋白等)等［4］。随着皮肤氧化机制认识的深入，更多基于细胞、基因或蛋白水平的敏感而特异的检测指标将得到开发。

2 皮肤抗氧化评价的动物模型

动物模式的抗氧化测试方法包括局部皮肤损伤模型、疾病模型和转基因动物模型，主要用于抗氧化机制研究和疾病治疗研究，以阐明氧化损伤与疾病的关系。

2.1 紫外线照射模型

在诱导动物皮肤氧化应激方面，紫外线是最常用的造模工具。动物常选用是豚鼠、C3H/HeNTac小鼠或无毛转基因小鼠。多以模拟某一波长的紫外线进行局部照射，如UVB照射造成皮肤老化和紫外线损伤。在此之前或之后涂抹一段时间的抗氧化物质，随后处死动物，将动物皮肤剥离，采用毛细管气相色谱法、电子捕获技术或病理切片等进行组织内损伤分析，或采用组织匀浆法测量组织内SOD、GSH、GSHPx等指标衡量氧化应激反应的情况［5］。

动物全身暴露于紫外线照射下首先会产生皮肤的氧化损伤效应，朱彦君［6］等建立的无毛小鼠皮肤光老化模型，动物皮肤经UVB照射后应用皮肤图像分析系统、皮肤组织学及特殊染色方法对皮肤纹理、表皮、真皮、基底膜、粘多糖、胶原纤维、弹性纤维等变化进行对比观察。此外暴露也会产生其它的全身性反应，如干扰免疫系统和情绪反应。因此，动物模型在研究包括皮肤在内的全身系统反应方面具有一定优势。例如研究氧化损伤中免疫系统所起的作用，利用动物模型研究体内不同激素水平对紫外线照射后皮肤变化的影响，探讨雌激素在拮抗紫外线损伤中的作用，还可综合考量受试物经皮肤及动物体内代谢变化的影响。

但是，利用动物模型检测氧化指标的缺陷也是显而易见的。首先，紫外线照射会产生一定热量，动物体积小，热量代谢的速度与途径与人体不同，这会使某些对温度敏感的指标发生变化;其次，动物试验影响因素较多，这给单纯评价紫外线皮肤损伤后果带来不便，如雌激素是已知的可拮抗紫外线作用的物质，如采用雌性动物则无法单独评估紫外线的损伤作用;再次，由于动物皮肤对紫外线的耐受性与人不同，往往使用动物造模时不能一次性达到目标的剂量，需要反复照射，易造成动物的生理和情绪应激。研究发现，热应激和束缚应激均会对小鼠的凝血系统产生影响，推测也会对抗氧化指标产生影响。

2.2 物理及化学物刺激模型

物理刺激造成氧化应激的常用方法包括缺氧法、剥夺睡眠法和高温暴露法，造成动物整体生理代谢产生氧化应激的状态。化学物刺激可分为直接皮肤涂抹造成皮肤炎症和腹腔注射法造成全身反应。根据实验目的不同选用的化学变应原也不同，例如，1%的2，4-二硝基氯苯(DNCB)涂抹小鼠皮肤，可造成变应性皮炎，腹腔注射黄嘌呤氧化酶加次黄嘌呤造成全身氧化应激［7］。物理法及化学物刺激法在运动学和职业卫生领域应用较为广泛，便于模拟各种非正常状态下的暴露;但是这两类造模方法会造成动物极大的痛苦，动物的个体差异也会影响实验的稳定性和可重复性。

2.3 全身抗氧化模型

全身抗氧化功能评价主要用于保健食品，需要测试动物使用产品一段时间后血液的抗氧化水平，但易受到外界因素的干扰。体内动物试验的结果存在人群外推的风险，经口摄入途径的食品抗氧化能力的测试方法也不适用于皮肤表面使用产品的抗氧化水平的测试。动物试验普遍周期较长、成本高，不适用于大量活性原料筛查和成品功效评估。而且，目前化妆品的开发趋势已转向多种功能的复配组合，如美白、防晒、保湿、除皱等功能性化妆品均不同程度具有抗氧化功效，利用动物模式评估这些综合效果显然是不合适的。因为这些产品的最终目的是为了改善人体皮肤结构和功能，但人与动物的皮肤结构存在差异，代谢途径及方法亦有所不同，因此动物试验结果与人体试用结果不具有可比性。

3 动物替代方法

皮肤氧化与抗氧化稳态的失衡是导致皮肤亚健康问题的重要因素，氧化应激可从多个方面造成细胞、组织、器官的损伤。大多数观点认为自由基是造成皮肤氧化损伤的元凶，因而现阶段多数评价方法把检测自由基水平的降低或清除自由基的能力认为是抗氧化功效的证据，这些检测系统包括化学方法、临床方法、细胞方法。

3.1 化学方法

化学方法通常以易于氧化的底物为测试系统，加入氧化物质发生化学反应形成氧化产物(如各种活性氧和自由基)，然后加入抗氧化剂检测其自由基清除能力作为判断依据。化学检测法具有快速、低成本的优点，可实现大量样本的快速筛查，缺点是反应体系过于单一，标准化程度不高，检测结果与体内实际应用效果存在差异。

3.2 临床试验

基于人体志愿者的临床功效试验主要用于终产品的评价，不仅可进行皮肤抗氧化产品的评价，还可评估抗氧化剂对其它功效作用(如保湿、防晒、美白、去皱)的相关性。通过试用产品后总的皮肤抗氧化水平监测和总体皮肤功能改善情况综合反应产品的性能。其优点表现在能够在宏观水平监测皮肤氧化的结果，包括皮肤结构和特性的改变，如水份流失下降、皮下胶原蛋白重建、色素沉着变浅，以及皮肤光泽度、光滑性和纹理的改善等。使用针对性强和灵敏度高的非介入测试仪器可以了解上述皮肤功能的变化，如全脸分析系统和色斑定量分析系统可综合判断产品试用前后皮肤色素沉积的改善变化［8］。临床试验的缺点是受样本量限制和伦理道德因素的制约，难以实现大规模测试，而且只能对已知安全的产品进行测试，不能用于大规模的新物质筛选。

3.3 细胞测试和方法

3.3.1 细胞测试系统

基于细胞的抗氧化检测方法可选用皮肤相关细胞或血细胞，前者包括永生化的角质细胞(如HaCaT细胞)、小鼠成纤维细胞(L929，3T3)，也可以采用人原代皮肤成纤维细胞和角质细胞。个人护理产品的功效评价最好选取来源于人的试验系统为测试对象。有研究采用UVB诱导的角质细胞氧化损伤模型，发现了米糠中富含抗氧化物质［9］。有人用永生化的HaCaT细胞研究石榴提取物，证明其具有抑制UVB诱导的氧化应激和光老化的作用［10］。Gruber等［11］用人原代成纤维细胞和角质细胞研究了多种皮肤抗氧化剂的细胞毒性和作用细胞24 h后基因组的变化，发现所有抗氧化剂均引起两种细胞上调的基因是 ACLY、AQP3、COX1、NOS3和PLOD3，两种细胞均出现下调的基因只有 PGR，为开发新的抗氧化损伤生物标志物奠定了基础。

来源于外周血的红细胞和白细胞也可用于抗氧化检测。红细胞不仅是体内输送氧的载体，还对维持白细胞活性和正常状态起作用。在抗氧化方面，红细胞保护血管壁微管结构、组织和血管内的其他细胞免受氧化损伤。利用红细胞的抗氧化功能可检测未知物的抗氧化效果。但血细胞检测抗氧化的方法多用于保健食品抗氧化功效的评估，反应的是全身抗氧化效果，与应用于皮肤局部的化妆品相关程度不高［12］。

3.3.2 细胞检测指标

不同于动物模型，基于细胞模式的生物学评价可以根据研究需要设计不同的方案，从而实现复杂机制的研究和筛选更敏感的生物标记物。如研究低剂量长期UVA照射细胞的氧化损伤作用，可动态监测培养液的细胞损伤指标;研究急性UV暴露或化学物氧化损伤后抗氧化剂对细胞的恢复作用，可设计后孵育步骤;研究低剂量抗氧化剂的细胞保护作用，可通过基因微陈列技术筛选多种细胞的共同生物标志物［11］。

皮肤氧化损伤是皮肤相关细胞多通路共同参与的复杂过程和结果，有的指标是氧化损伤的底物(如谷胱甘肽)，而另一些是损伤的中间产物(4-羟基壬烯酸);有的指标在早期出现，如蛋白质氧化和DNA的损伤(8-二氢-2'-脱氧鸟苷和增殖细胞核抗原表达)，有的后期发生(凋亡);有的结构稳定易于检测，而有的出现短暂难以定量。更多的关键分子可能还不为人所知。因此细胞模型的抗氧化测试指标必然是随着机制的认识深入而不断改进，也随着检测技术的发展而不断进步，例如，最直观的氧化损伤结果是细胞凋亡或坏死，传统的MTT法无法分辨，采用流式细胞术可很好区分细胞两种不同的死亡状态。

ROS是导致细胞氧化损伤的直接原因，测量细胞内ROS的数量是最直接的抗氧化功效检测指标。而用无细胞的化学测试系统无法解释活体细胞ROS产生和清除的复杂机制。为了研究多种植物甾醇阿魏酸酯类物质的抗氧化活性和清除自由基的机制，Md Islam 等［13］先用低剂量的10 μM 测试物预处理3T3成纤维细胞过夜，再用100 μM的 H2O2处理细胞2h诱导ROS产生，然后用DCFH-DA荧光探针检测细胞内产生的ROS自由基。结果表明环木菠萝烯醇阿魏酸酯(CAF)和阿魏酸乙酯能显著降低ROS水平，并通过抑制NF-κB活性进而降低前炎症因子的产生而起到抗炎的效果。这是利用细胞系统阐明同一类植物活性抗氧化物质的结构与活性之间关系的典型文献。

传统检测细胞膜的氧化损伤水平，通常采用直接测定脂质过氧化酶，或测定谷胱甘肽S-转移酶间接反应，现在很多研究已改用检测脂质过氧化过程中产生的4-羟基壬烯酸水平，后者更为敏感。总之，使用某一终点的测试不足以衡量抗氧化的机制和效果，建立多个检测终点并行和动态的试验组合可以有效和全面评价抗氧化剂的活性。

3.4 皮肤模型系统和方法

皮肤模型系统可以分为离体动物皮肤和体外重建人体皮肤三维模型两大类，后者最初用于皮肤刺激/腐蚀性、皮肤吸收和光毒性的检测和研究，基于表皮模型的皮肤刺激试验替代方法已成为国际标准广泛使用。近年来，这些模型也逐渐应用到化妆品皮肤功能改善的检测和研究中。

3.4.1 离体皮肤模型

日本学者［14］将5周龄的 SKH-hrl雌性无毛小鼠背部皮肤取下，平铺于无菌尼龙网上离体培养，随后进行UV照射处理，药物添加方法与细胞培养方法一致，均是添加于培养基中，其后进行指标的测量和分析，包括病理切片、DNA、蛋白组学、氧化应激产物、细胞增殖损伤分析等。这些指标广泛而多样，大大提高了动物的利用效率，可以视为动物实验的优化方法。

3.4.2 Episkin模型

Episkin皮肤模型是欧莱雅公司研发的体外重建模型，除了用于皮肤刺激的法规检测外，有学者用该模型研究皮肤暴露于臭氧引起氧化应激的剂量关系，用于研究抗氧化剂的防护作用。还用于化妆品配方工艺的研究中，如微乳包囊技术是近年来化妆品工业广泛使用的新工艺，采用这种技术可使具有相同功效但极性不同的多种抗氧化剂组合在一起(例如亲脂性的VE和亲水性的VC)制成微乳，用皮肤模型可反复进行工艺的尝试，保证用于人体时保持热力学稳定，提高了产品整体抗氧化功效［15］。还原型和氧化型谷胱甘肽的水平是反应皮肤氧化状态非常敏感的指标，用皮肤模型可以动态测定不同UVB照射后，皮肤细胞谷胱甘肽的水平，研究试用产品后氧化还原稳态的影响过程，对于产品开发非常有用［16］。

3.4.3 EpiDermTM模型

EpiDerm皮肤是美国MatTeck公司开发的商品化皮肤模型。FT-200是全层皮肤模型，表皮层由基底层、棘层、颗粒层和角质层组成，与体内结构非常相似，真皮层为含有成纤维细胞的胶原基质，是进行体外研究的有用模型。该皮肤模型可用于植物来源的抗氧化剂的筛查研究。例如化学检测表明石榴含有花色素和水解单宁等强抗氧化活性成份，为证明石榴不同部位提取物的光化学保护作用。Afaq等用EpiDerm FT-200全层皮肤模型为测试系统，先用抗氧化剂处理1 h，再用 UVB照射(60 mJ/cm2)，后孵育12 h，检测DNA损伤和蛋白质氧化指标，如环丁烷嘧啶二聚体(CPD)、蛋白质氧化和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。此外，该皮肤模型具有类似于皮肤的活性，UVB照射后可表达胶原酶(MMP-1)、明胶酶(MMP-2，MMP-9)，基质溶解素(MMP-3)、marilysin(MMP-7)、弹性蛋白酶(MMP-12)和弹性蛋白原，用明胶酶谱分析技术可研究植物抗氧化剂引起 MMP变化的情况［17］。EpiDerm模型也可用于配方的优化，如检测含保湿剂的抗氧化配方的总的抗氧化能力(TAC)是否比不含保湿剂的配方高［18］，检测指标是体外孵育24 h后检测培养基和组织中TAC和谷胱甘肽过氧化物酶活性。

3.4.4 Phenion皮肤模型

Phenion是德国汉高公司生产的一种商用皮肤模型，全层皮肤模型含有表皮层和真皮层，可以研究紫外线对真皮层胶原蛋白、弹性蛋白、非特异性胶原蛋白酶、核心蛋白多糖等成分的影响。已知UVA照射能引起多种皮肤损伤效应，短期作用包括形成ROS、炎症、光氧化、急性晒黑和持续晒黑、DNA损伤等，长期作用导致弹性组织变性和光老化，而ROS形成是许多毒性作用通路的共同起点。尽管真皮和成纤维细胞和UVA照射的最终靶点，但是表皮作为UVA诱导的抗ROS氧化作用的第一道防线也参与并起到关键的作用。UVA的长期作用主要是真皮层的老化，而动物与人相关性差异太大，志愿者受伦理的约束不可能长期暴露于UVA下进行研究。因此，体外重建模型成为首选的方法。Meloni等［2］使用 PhenionR FT全层皮肤模型进行单次和反复UVA暴露的生物学反应的研究。

皮肤模型的优点在于可根据研究目的选择不同结构的模型，如研究 UVB的损伤可选择表皮模型，研究UVA的损伤可选择全层皮肤模型;皮肤模型还可模拟生态环境研究低剂量长期的紫外线或环境化学物的暴露，以及研究复杂的多种氧化因素的混合作用;还可以进行不同抗氧化配方之间的比较，而上述测试临床研究和动物模型均不易实现。随着组织工程技术的发展，皮肤模型的稳定性和仿真性会不断提高，今后将广泛用于抗氧化机制研究和产品开发过程。

总之，尽管目前氧化应激机制尚不完全明了，但随着氧化应激分子调控机制研究的不断深入，不仅为抗氧化产品的开发提供了新的思路，也为建立有效科学的检测评价方法提供了新的理论依据。通常基于动物模型的皮肤抗氧化功效评价适用于单剂量UV照射和急性化学试剂局部皮肤暴露，适用于氧化损伤全身效应的研究。化学方法虽然简单快速，但与生物体内效果相去甚远。而基于体外细胞或器官水平的测试可克服动物试验的缺点，而且比较灵敏，试验周期短，可实现高通量，适用于大量样品的抗氧化活性筛查，而且可以提供产品安全性的数据，其结果可直接作为临床试验的依据。特别是近年来，在减少、优化和替代动物实验的3R原则下，使用非动物实验方法进行化妆品功效研究将成为必然的选择。

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