TCRαβ分子识别抗原肽-MHC复合物的争议问题探讨①

沈 晗 邵红伟 黄树林 (广东药学院生命科学与生物制药学院，广州510006)

T细胞抗原受体(TCR)是T细胞表面的特征性标志分子，其与CD3分子组成的TCR-CD3复合体，是进行抗原识别，发挥细胞免疫重要功能的基础。一般认为，TCR必须识别抗原肽-MHC分子复合物才能活化T细胞，其中CD4+T细胞识别MHCⅡ类抗原，CD8+T细胞识别MHCⅠ类抗原。TCR分子是由两条不同肽链构成的跨膜蛋白，肽链的种类有α、β、γ、δ 四种，根据组合的差异，可分为 TCRαβ+T细胞和TCRγδ+T细胞，其中TCRαβ+T细胞在发挥特异性细胞免疫过程中发挥重要作用。有关TCRαβ分子识别抗原肽-MHC分子复合物的基本分子机制已形成了经典的免疫学理论，但其中有关MHC分子限制性、CD4及CD8分子的辅助性以及TCR分子α链与β链在识别过程中的地位及作用等问题还存在不少存有争议的地方，本文将介绍相关领域的研究进展，并结合自己的综合分析，对TCRαβ分子识别抗原肽-MHC复合物过程中的一些争议问题进行探讨。

1 TCR分子识别抗原肽的MHC非限制性机制

对于TCR识别抗原肽的MHC分子限制性问题也有着不同的观点，在较早期的研究中[1]，已有研究者证实利用高浓度的抗HLA抗体封闭HLA分子后CTL仍能够裂解靶细胞，但由于当时已知的HLA亚型没有现在全面，所制备的抗体也是有限的，且在这些实验中都是利用的高E∶T比(效应细胞与靶细胞比例)的实验方式，而当时的实验对照组也出现了靶细胞被裂解的现象，所以并不能用此结果来证明CTL的杀伤过程是非MHC限制性的;后来有研究小组建立了两个CTL克隆，其只表达一种类型的TCRαβ分子，但具有HLA限制与非限制性两种机制介导的对靶细胞的识别和杀伤能力[2]。要明确TCRαβ对抗原的非MHC限制性识别机制必须找到TCR分子识别的抗原表位，但目前有关这方面的报道非常有限，有研究证实，在外周血中确实存在一些特殊的TCRαβT细胞，它们的TCR分子可能通过非MHC限制性机制，识别一些结构十分复杂的抗原分子，从而被活化[3]。近年来关于肽类抗原被TCRαβ非MHC限制性识别的报道只发现了唯一一种抗原表位-粘蛋白 Mucin 1(MUC1)[4，5]，它是表达在导管上皮细胞和其来源的各种肿瘤细胞上的一种跨膜糖蛋白，超过80%的人类癌症都表达MUC1分子[6]，研究发现TCR与MUC1结合的抗原表位是由20个氨基酸进行超过100个串联重复而成的复杂结构，此结构排列有序且十分牢固，与TCR具有很高的亲和力[7];TCRαβ对其的特异性识别不需要MHC分子的参与，但T细胞上的其他共刺激分子在识别中发挥重要作用，其中 ICAM-1、LFA-1、LFA-3和 CD2分子与MUC1抗原表位的相互作用是CTL完全活化的必需条件，而CD8分子在此过程中也发挥一定作用。如果 CTL只依靠 TCRαβ识别 MUC1抗原肽，只能部分活化 CTL，微观上只表现出短暂的Ca2+内流，而没有ZAP-70等关键活化信号通路分子的磷酸化出现，CTL也不出现增殖反应;如果有了上述黏附分子的参与，则可以介导CTL的完全活化，整个过程与MHC限制性抗原肽激活CTL的情况没有明显区别[8]。TCR对其他非肽类抗原表现出的非MHC限制性识别的报道比较多见，包括细菌包膜脂类、糖蛋白上的糖链部分等[9，10]，相比较而言，非MHC限制性的肽类抗原发现得实在太少。通过以上的研究报道我们推断，肽类抗原的非MHC限制性识别并不是抗原识别的普遍现象，可能只是作为经典的MHC限制性识别理论的一种补充，且主要发生在那些结构(抗原表位)极为复杂的蛋白质上，同时这种识别虽不需要MHC限制性，但单纯的依靠TCRαβ分子与这些抗原表位的相互作用也不能彻底完成对T细胞的活化，还需要其他相关黏附分子的参与[8]。近年来，也发表了一些关于T细胞非MHC限制性识别的研究报道，Somasundaram等人[11]研究发现，从原发性黑色素瘤病人的外周血淋巴细胞中建立了一株CD8+CTL克隆，表现为对所有HLA亚型(包括Ⅰ类和Ⅱ类)的黑色素瘤细胞都有识别杀伤活性，因此，CTL克隆对黑色素瘤的抗原识别是非HLA限制性的，而研究显示其对其他肿瘤细胞无杀伤活性，由于黑色素瘤细胞并不表达MUC1抗原肽，所以可能存在着其他黑色素瘤相关抗原介导了这种非MHC限制性的抗原识别反应的发生。在最近的一项报道中，研究者建立了一株CD4+T细胞克隆，它能够以非MHC限制性方式识别并裂解自体与异体的人肾癌细胞，进一步分析其TCR分子配体结构，发现配体中并不包含MHC分子配基结构[12，13]。由此可见，我们对于经典的MHC限制性识别过程的认识仍然有待更加深入的研究。

2 CD4与CD8分子在MHC限制性TCR识别抗原肽中的作用

TCR对抗原肽的MHC限制性识别既涉及到MHC分子对抗原肽的呈递，又需要TCR识别抗原肽的辅助受体CD4和CD8分子的参与，经典免疫学理论认为，CD4分子与MHCⅡ类分子结合，CD8分子与MHCⅠ类分子结合，起到增加TCR与抗原肽-MHC复合物相互作用的敏感性和牢固性，促进T细胞活化信号转导的作用[14，15]。但近年来的一些研究对CD4、CD8分子与MHC分子结合的必需性和限制性(即CD4必须与MHCⅡ类分子结合，CD8分子必须与MHCⅠ类分子结合)提出了新的认识。有研究发现，CD4分子实际上与MHCⅡ类分子的亲和力非常低下，对提高TCR分子与抗原肽-MHC复合物结合稳定性并没有帮助[16，17]。而CD8分子在大多数MHCⅠ类分子限制性T细胞识别抗原肽的过程中都是必需的，这些T细胞所表达的TCR一般属于抗原肽低亲和力TCR，CD8分子能够提高TCR分子与抗原肽-MHC复合物的亲和力;而在一些表达抗原肽高亲和力TCR的T细胞，其对特定抗原肽的识别和杀伤对CD8分子的表达不是必需的，这种TCR分子在结构上与特定抗原表位具有很高的契合性，能充分结合抗原肽/MHCⅠ类分子复合物，这样不需要CD8辅助受体的参与，就能为T细胞的完全活化提供必需的信号[18，19]。由于目前发现MHCⅠ类肿瘤相关抗原肽的种类较多，Ⅱ类抗原肽较少，因此，有人用识别特异性MHCⅠ类抗原肽的高亲和力TCR分子修饰CD4+T细胞，使其表达这种TCR，经过改造后的CD4+T细胞能够特异性地识别抗原呈递细胞呈递的此种MHCⅠ类抗原肽(但不能直接识别肿瘤细胞表面的抗原肽)，能够被完全活化，分泌相应细胞因子并克隆增殖[20]。可以看出，如果TCR分子与特异性抗原肽-MHC复合物的结合能力很强，那么T细胞对该抗原肽的识别和随后自身的活化是不依赖CD8分子的，所表达的这种高亲和力特异性TCR分子是识别过程的关键所在。最新的研究结果显示，CD4与CD8分子的主要功能是对T细胞膜内酪氨酸激酶Lck的募集，进而促进其与TCR/CD3复合物的作用，将活化信号传入T细胞内，与CD4、CD8分子是否促进TCR-抗原肽MHC复合物亲和力没有关系[21，22]。值得注意的一点是，如果TCR分子与其特定识别的抗原/MHC复合物的亲和力过高，当T细胞遇到该种抗原时导致活化诱导的细胞死亡(AICD)发生[23]。同时有研究证实，TCR与抗原/MHC复合物的亲和力高低并不与T细胞后续的活化程度成正比，而T细胞的高活性也并非绝对的需要T细胞对抗原的高效识别[19]，但也有其他一些研究的观点与此相反[24]。出现这些矛盾结果的原因可能是由于不同研究者所选取的实验模型及方法的差异造成的，不过有一点是我们可以肯定，即TCR与其特异性识别的抗原/MHC复合物之间的亲和力高低影响着后续T细胞的反应，在正常情况下，二者是相互协调的关系，能保证T细胞发挥正常的免疫功能，但如果出现特殊情况(例如肿瘤、自身免疫病等)，T细胞识别抗原能力的变化则可能导致T细胞的免疫功能失调。

3 TCR分子α链与β链在识别抗原肽-MHC复合物中的功能及地位

我们知道TCR分子由一条α链和一条β链组装而成，那么在识别过程中是α链和β链的哪些具体部位发挥识别作用，二者在抗原识别中的地位是否同等重要等问题都需要我们深入理解。TCRα链和β链都由可变区(V区)和恒定区(C区)两部分组成，V区又可分为CDR1、CDR2、CDR3和HV4四区，其中的CDR3区被认为是识别抗原肽-MHC复合物的关键部位，由于CDR3区是由V、(D)、J片段的重排连接后的基因片段编码而成，连接处可随机插入或丢失数个核苷酸，使最终翻译得到的CDR3区高度变化，因此要得到两个氨基酸序列完全相同的CDR3区几乎不太可能[25]。有研究发现，在抗原识别过程中，TCR分子V区中的CDR1和CDR2区与MHC分子的识别密切相关，而HV4区在超抗原与TCRVβ链的结合时发挥重要作用，但真正起到对抗原肽特异性识别作用的主要还是CDR3区[26]。有人建立了TCRα链和β链转基因小鼠模型[27]，利用不同的抗原肽免疫小鼠后，发现TCR分子氨基酸序列的改变主要发生在Vα和Vβ链的CDR3区，利用X射线晶体衍射技术及核磁共振技术对TCR与抗原肽-MHC复合物的结合位点进行分析，发现TCR的CDR3环状结构的关键位点直接与抗原肽特定表位的氨基酸残基结合，而MHC分子的保守氨基酸残基与TCR分子的V区广泛结合，所以，就是通过特定蛋白质残基之间的非共价结合作用保证了TCR对抗原肽-MHC复合物的充分识别[28]。

由于TCRVαβ是由Vα和Vβ链共同构成了抗原肽-MHC复合物的识别位点，那么Vα和Vβ这两条链在识别过程中发挥作用的地位是否完全等同呢?利用单链TCR转基因小鼠实验，研究者对这个问题进行了较深入研究。有研究者报道，TCR的Vα和Vβ链在抗原识别过程中发挥的作用同等重要[29];但也有更多的实验结果证实，在抗原识别过程中，TCRVα链起着决定性的作用。有人利用同一TCRVα链与不同的TCRVβ链进行配对，建立表达这种杂合状态TCR分子的转基因小鼠和T细胞克隆，进行特异性抗原的识别实验，发现虽然TCRVβ链的组成各异，但只要具有相同的TCRVα链，这种基因改造的T细胞表现出针对同一种抗原的特异性[30，31]。利用X射线晶体衍射技术观察分子间相互作用时发现，TCRVα的氨基酸位点在抗原肽识别中起关键性作用，因为TCRVα的CDR3区插入到抗原肽-MHC复合物中的空间面积比CDR3β更大，具体分析TCR分子与抗原肽相接触的位点发现，在总共27个接触点中有23个位于Vα链而只有4个涉及到Vβ链，除此之外，TCR分子与抗原肽-MHC复合物结合的支点和转向角会调节CDR3α区与抗原肽的接触位点[30，34]。在针对 HIV-P18 抗原肽的TCR识别实验中，证实TCRVα链表现出Vα42H1-Jα25基因的表达特异性，而与之配对的TCRVβ链则表现为基因重排后的多样性(即表现为各种不同的TCRVβ基因家族)[32];利用黑色素瘤相关抗原Melan-A诱导出特异性识别该抗原的多个T细胞克隆，然后利用测序技术检测这些T细胞克隆编码TCRVα和Vβ链基因的序列，发现绝大多数TCRVα基因表现出Vα2.1+表型，而TCRVβ基因则表现出明显的多样性[33];而有研究者利用黑色素瘤分化抗原TRP-2的基因疫苗免疫动物，也发现了TCRVα5基因的优势表达[34]。最近的一项研究证实[35]，TCR CDR3α区氨基酸序列的特异性决定着肽与TCR分子结合的特异性，而CDR3β区只是与肽存在接触关系，与肽识别的过程只与其长度的多少有关，不涉及其氨基酸序列。从以上这些报道中可以明显地发现，TCRVα链在抗原肽-MHC复合物特异性识别过程中发挥了决定性的作用，决定了TCR对抗原肽识别的特异性这一关键问题，为什么会出现这种情况呢?我们可以从TCR分子的发育过程找到一些可能的解释，在生理状态下，T细胞的发育过程中首先进行的是TCRβ链的重排，然后具有完整β链的嵌合T细胞再进行α链的重排，这样最终生成的具有完整TCRαβ链的T细胞中，如果具有相同的β链(其概率也是比较低的)，要使他们的α链也相同的概率就更低了，因为α链的重排时间在后，同一条β链(其概率也很小)可能与多条α链搭配，而同一条α链几乎不可能与超过一条的β链相搭配，所以我们可以推断，TCR分子对抗原肽识别的多样性和特异性更多地体现在α链上[31]。当然，TCR分子既然由α和β两条链构成，在抗原识别过程中，β链的作用也是不容忽视的，有些研究也发现，抗原刺激后也会出现一些TCRVβ基因的优势表达;不同的Vβ链与同一Vα链组合后对抗原的结合能力存在差异，有些类型的Vβ链与Vα链组合后能表现出更强的抗原识别作用，更利于活化T细胞;β链的多样性在TCR分子组装与识别功能中有重要作用[36]。同时，我们也应注意到，参与TCR识别抗原肽-MHC复合物过程中的其他辅助分子对整个识别活化过程的成功也是必不可少的[37]。

4 结语

以上虽就有关TCR分子特异性识别某种抗原肽-MHC复合物过程中存在争议的部分问题做了分析和论述，但我们可以看到整个识别过程实际上是十分复杂多变的，各分子在识别过程中的地位可能在T细胞识别不同抗原时发生显著的变化，因此在很多情况下不能单单依靠简单的体外实验模型进行确证，可能还需要设计更加合理的实验尽可能地模拟生物体内环境中T细胞识别抗原的真实过程，只有这样才可能系统、全面、切实地揭开TCR对抗原肽-MHC复合物的识别机理。

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