磁性纳米粒子在检测中的应用

赵晓丽 周 琦 张 凯 邓丛良*

（北京出入境检验检疫局 北京 101312）

1 前言

磁性纳米粒子（Magnetic Nanoparticles，MNPs）是指含有磁性金属或金属氧化物的超细粉末且具有磁响应性的纳米级粒子，具有独特的超顺磁性能[1]。由于其比表面积大、表面活性中心多、表面反应活性高、吸附能力强、催化能力高、毒性低且不易受体内和细胞内各种酶降解等特点，在多个领域具有广泛的应用前景。

磁性纳米粒子的种类很多，较常用的有金属合金、氧化铁、铁氧体、氧化铬等，其中氧化铁（γ-Fe203、Fe304）磁性材料应用最多[2]。磁性纳米粒子通过表面共聚和表面改性的方法，能与有机物或高分子聚合物或无机材料相结合形成核壳结构的磁性复合粒子，既具有磁性，又具有表面活性基团，能进一步和细胞、酶、蛋白质、抗体及核酸等多种生物分子偶联。在外加磁场的作用下，磁性粒子能够很方便地和底液分离，具有操作简便和分离效率高的优点。此外，磁性纳米粒子具有大的比表面积，为修饰多种高密度分子探针提供了基础，在细胞分离、蛋白质纯化及DNA分离检测等领域显示出广阔的应用前景[3-6]。

2 基于磁分离技术的检测技术

磁性分离技术（Magnetic Separation, MS）是依据物质的磁性差异，在磁场作用力的驱动下，把磁性组分从非磁性组分混合物中分离出来的一种分离技术。传统的磁性分离理论方法已经在许多工业过程中获得了应用，如冶金工业中的矿物磁选分离。由于生物体系中的绝大多数生物分子都无磁性，为了给欲分离的目标生物分子赋予磁性，需要预先制备一种磁性载体颗粒作为运载工具，借助于磁性分离装置，对目标生物分子进行负载、运载和卸载等分离操作，从而实现目标生物分子的磁性分离过程。

磁性分离技术因其具有快速、简便、灵敏等特点，近年已被广泛地应用于疾病诊断、食品安全快速检测、环境检测和植物病毒检测的研究中[7-8]。磁分离技术可以直接应用于目标物质的检测，也可以和现有的其他生物技术，如分子生物学检测技术、免疫学检测技术、荧光检测技术等相结合，从而实现更为有效简便的快速检测[9]。

免疫磁性分离技术（Immunomagnetic beadbased separation, IMS）是目前应用最广泛的磁分离技术，它整合了免疫反应的高度特异性和磁性分离快速、简单的优点。

2.1 磁分离-PCR检测技术

传统的PCR检测技术虽然灵敏度高，但是因为其所使用的样本往往是活菌和死菌的混合体，因此假阳性反应较高。利用磁分离技术先分离或富集目标生物分子，然后再结合目标物质的指纹基因进行检测，可以减少培养基质的影响，提高检测的速度和灵敏度。

2.2 磁分离-ELISA检测技术

普通的ELISA技术采用的酶标板是一个固相载体，具有固/液相反应接触面积小，联接的抗体易脱落，反应速度慢且不彻底等缺点。磁分离-ELISA技术(MS-ELISA)是一种以磁性纳米材料代替传统ELISA中的酶标板，将ELISA的显色系统与磁分离技术相结合而形成的一种新型检测方法。利用纳米材料的高比表面积、易于形成胶体溶液等特性，MS-ELISA法中的抗原-抗体分子接触面积变大，反应较为彻底，此外磁分离使缓冲液的交换操作更为简便快速，灵敏度也得到了提高[10-12]。

2.3 磁分离荧光分析检测技术

荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、用样量少、操作简便等优点。磁分离荧光分析技术是一种将磁分离技术与荧光分析相结合的技术，通常先以磁分离选择目标物质，再利用荧光物质进行定性或定量检测。

3 磁分离技术在检测中的应用

基于磁性纳米粒子的磁分离技术在生物分子检测中的应用一直是生物分析化学领域研究的热点问题之一，利用磁性纳米粒子特殊的表面效应、体积效应、量子效应等可以在生物分子检测中明显地提高分析与检测的灵敏度和选择性，因此在多个领域有着非常广阔的应用前景。

3.1 磁分离技术在医学检测中的应用

在医学领域，为了分析检测或其他应用，通常需要将被研究的生物实体与其所在的环境分离。应用具有生物相容性的磁性纳米粒子的磁分离技术是达到该要求的一种方法。

癌症是目前较难医治的疾病之一，但大量临床事实证明，癌变初期的治愈率相当高，因此治疗癌症的关键在于有效地早期诊治。目前确诊癌症最有效的手段是病理诊断，但准确性往往受限于操作医生的工作经验，早期病变容易漏诊、误诊。将纳米分离技术与生化检测技术相结合，能够对癌症进行早期诊断[13，14]，是及早预防和诊治癌症的重要方向，为临床上癌症的早期、准确诊断提供了良好的方法和依据。

纳米免疫磁粒子在磁场作用下具有高的特异性、浓缩性和可分离性，可以对外周血中肿瘤细胞进行富集、浓缩与分离，有助于癌细胞的发现。Taubert等[15]已用白细胞分化抗原（CD）45单抗标记免疫磁性微球将外围血中的白细胞去除，从而实现癌细胞的富集，随后用免疫细胞化学方法检测乳腺癌细胞。Nam等[16]用标记有前列腺特异性抗原（PSA）单抗的磁性微球，通过夹心法与血清中的PSA形成复合物，在磁场下分离血清中的PSA，然后用PCR或基因芯片技术检测，其灵敏度比常规的临床检测方法高6个数量级。Nakamura等[17]应用包被Ber-EP4的免疫磁粒子富集外周血中单核细胞，然后用免疫细胞化学方法检测食道癌细胞。目前，该技术还用于肺癌[18]、胃癌[19]、肝癌[20-21]和鼻咽癌[22]患者外周血中癌细胞的检测。

乙型肝炎是一种传染性疾病，只有早期诊断才能尽早隔离，从而控制其传播。张宝亮等[23]通过化学键连接的方法制备出表面偶联乙肝抗体的磁性复合微球，采用类“双抗原夹心酶联免疫法”对乙肝抗体的活性及优化效果进行了检测。通过性能检测比较，磁分离技术法检测灵敏度高于普通酶联免疫法。李成德等[24]通过实验得出结论：磁分离技术在HBV检测中的应用对乙型肝炎患者的临床诊断和疗效监测将有十分重要的意义。

另外，Van Helden等[25]将抗体连接的纳米磁性微球与高效率、快速的化学发光免疫测定技术相结合的自动检测系统，成功地用于血清中人免疫缺陷病毒1型和2型（HIV-1和HIV-2）抗体检测。Constanine等[26]通过使用磁分离技术和免疫PCR技术检测HIV病毒的P24蛋白，在每个反应中可以检测到10到100个P24蛋白分子，从而将检测灵敏度提高到不到一个病毒的检出能力，所有其他的现有方法中都无法达到。

3.2 磁分离技术在食品检测中的应用

随着人们对食品安全的重视，致病微生物的检测技术也朝着快速、准确、经济、环保方向迅速发展[27]。E.Coli O157∶H7、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌是引起食物中毒的主要致病菌。目前，免疫磁分离技术已广泛应用于这4种致病菌的检测。

Hand ley等[28]使用磁分离技术与化学发光标记ELISA复合的方式检测大肠杆菌E.Coli O157∶H7，达到了7.6×103个活细胞的下限，更把原来1d甚至数d的检测时间缩短到了75min。Notzon等[29]用IMS-荧光PCR技术相结合检测肉类中的沙门氏菌，12-13 h即可完成检测过程，IMS-荧光PCR在检测自然感染肉类和人工感染肉类上都具有较高的敏感性和特异性。Hudson 等[30]研究表明，将免疫磁分离技术与PCR结合，24 h内即可检出火腿中的单核细胞增生李斯特菌，检出低限为11 cfu/g。Alefantis等[31]用特异性多抗包被磁性纳米粒子，用荧光染料Alexa fluor 647结合特异的单抗来检测金黄色葡萄球菌，整个检测过程只需40-50 min，灵敏度很高（＜ 100 pg），而且采用此方法不需要二抗，适合于微量样品的检测。

另外，免疫磁分离技术还用于检测其他致病菌[32-35]及食品样品中的病毒[36]。

3.3 磁分离技术在环境检测中的应用

目前已经有报道将免疫磁分离技术引入环境监测领域，用于对环境中自然水体、生活污水、工业废水、土壤环境中部分细菌、致病原虫、病毒和有毒有机物的检测。

Lee等[37]采用免疫磁粒子检测环境中的大肠杆菌，灵敏度提高到了20 CFV/100 mL，检测时间则由原来的超过24h缩短到1h。张凡飞等[38-39]采用PCR法、免疫磁分离法和神奈川现象培养基三者结合的方法成功的从环境中分离出了用一般细菌培养分离方法很难分离到的TDH阳性副溶血性弧菌，极大地提高了环境样品及食品中病原性副溶血性弧菌的检出率，也为研究TDH阳性副溶血性弧菌在环境中的分布及预防由其引起的食物中毒提供了依据，该方法对于水和食品中致病微生物的快速分离和检验也有着重要的应用价值。Islam等[40]采用IMS和PCR检测粪便中的志贺菌，该方法简单、快速，检测所需时间为7h，在粪便样品中的检测限为10 cfu/g。李凤仪等[41]用抗志贺氏菌抗体包被醛基磁性微球，浓集水中的志贺氏菌，然后用 PCR 进行检测，取得了较好的结果。Hulten等[42]检测了秘鲁饮用水中幽门螺旋菌，该研究用抗幽门螺旋菌IgG包被的免疫磁粒子富集幽门螺旋菌，结合PCR扩增，得出结果证明，秘鲁某些饮用水中存在幽门螺旋菌，与先前流行病研究结果一致。

1996年，美国环保总局开始将免疫磁性分离机技术应用于卵囊和孢囊的检测过程，这是目前国际上最为常用的标准检测方法[43]。免疫磁性分离用于多种水域中隐孢子虫的检测，并提供了很高的检测率。囊式过滤器用于免疫磁性分离后成为检测环境样中的隐孢子虫的最有效的方法[44]。Mahbubani[45]采用免疫磁粒子分离技术和PCR扩增结合的方法，检测环境水中污染贾第鞭毛虫包囊DNA，研究发现，免疫磁粒子法分离环境水及饮用水中贾第鞭毛虫，并结合PCR扩增目的基因，可提高检测的准确性和灵敏度。

杨万等[46]建立了一种免疫磁珠分离技术联合实时定量PCR快速定量检测水中轮状病毒的方法，通过制备能够分离水中轮状病毒的特异免疫磁珠，优化分离条件，建立了免疫磁珠分离前处理方法，并与逆转录、实时定量PCR结合，成功用于水中轮状病毒的检测。

胡寅等[47]通过将通用抗体固化在自行制备的纳米磁珠表面，建立了有机磷农药多残留纳米磁珠间接竞争ELISA方法。与传统ELISA检测相比，纳米磁珠免疫检测方法对多种有机磷农药具有显著的识别作用，方法灵敏度大大提高。

3.4 磁分离技术在植物病毒检测中的应用

植物病毒病害是一类重要植物病害，几乎在各类作物上都有发生，严重影响农作物的产量和品质。近年来，病毒病在世界各国的危害日趋严重，发现和报道的种类也日益增多。在重要植物检疫性病毒检测技术方面，我国出入境植物检疫采用的手段主要包括口岸现场检疫、生长季隔离检疫、实验室常规检验鉴定、指示植物鉴定、血清学检测和分子生物学检测等。当前已经有不少关于采用非特异性磁性纳米粒子和RT-PCR、实时荧光RT-PCR相结合技术检测植物病毒的研究。

阚春月[48]等以黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGM M V）作为研究对象，将磁性微珠与CGMMV抗血清混合后，制备成包被CGMMV抗体的免疫磁珠分离植物病毒，提取病毒核酸。邓丛良等以CGMMV[49]、南芥菜花叶病毒（ArMV）[50]、南瓜花叶病毒（Sq M V）[51]、李痘病毒（PPV）[52]等为研究对象，将磁分离技术与PCR技术相结合，首先利用经表面修饰特殊基团且不包被抗体的非特异性磁性纳米粒子随机吸附植物样品中的病毒粒子，然后用RT-PCR或者Realtime-RT-PCR方法检测病毒粒子，整个检测过程只需1-2h，检测灵敏度比传统Trizol方法提取病毒RNA提高了近10-100倍，减少了有毒有害物质的使用和劳动力的投入，有效去除了PCR反应抑制剂；与免疫磁分离方法相比省去了抗体的使用，降低了成本，提高了检测效率，非常适合口岸一线对植物病毒的检测要求。

4 总结与展望

随着生物技术的发展，多学科交叉的新型检测技术也将越来越多。纳米技术作为一门新兴学科被应用于多个领域，必将推动科学技术的进步和发展。与现有技术相比，基于纳米磁性粒子的各种检测技术将极大提高检测方法的特异性、灵敏度和速度等性能。到目前为止，基于纳米磁性粒子的检测技术已应用于生物医学、食品安全、环境等多个检测领域。但是此检测技术还不完善，还有很多需要改进和值得研究的地方，比如：检测灵敏度的提高、定量检测的实现、多元检测等。相信随着科学技术的进一步发展，通过磁性纳米粒子建立的各种自动化实验平台将在检测领域发挥更大的作用。

［1］ 朱屯，王福明，王习东.国外纳米材料技术进展与应用[M].化学工业出版社，2002，6：69-77.

［2］ 李荫远，李国栋.铁氧体物理学[M].北京：科学出版社，1978.

［3］Hafeli U, Schutt W, Teller J, et al.Scientific and Clinical Applications of Magnetic carrier[M].Plenum：New York, 1997.

［4］Weissleder R, Bogdanov A, Neuwelt E A, et al.Long-circulating iron oxides for MR imaging[J].Advanced Drug Delivery Reviews, 1995，16：321-334.

［5］Jordan A, Scholz R, Wust P, et al.Endocytosis of dextran and effect of intracellular hyperthermia on human mammary carcinoma cells in Vitro[J].Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 1999, 194：185-196.

［6］Liu Z L, Ding Z H, Yao K L, et al.Preparation and characterization of polymer-coated core-shell structured magnetic microbeads[J].Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 2003，265：98-105.

［7］ 马秀玲，黄丽梅，郑思宁，等.磁性微球的制备及研究进展[J].广州化学，2003，28（3）：58-63.

［8］Ugelstad J, Berge A, Ellingsen T, et al.Preparation and application of new monosized polymer particles[J].Progress in Polymer Science,1992, 17：87-161.

［9］ 翁仕强，潘迎捷，赵勇，等.纳米技术在食品安全快速检测中的应用[J].渔业现代化，2009，36（3）：56-59.

［10］Gehring A G, Crawford C G, Mazenko R S, et al.Enzymelinked immunomagnetic electrochemical detection of Salmonella typhimurium[J].Journal of Immunological Methods, 1996, 195（1-2）：15-25.

［11］Yazdankhah S P.Development and evaluation of an immunomagnetic separation-ELISA for the detection of Staphylococcus aureus thermostable nuclease in composite milk[J].Veterinary Microbiology，1999，67（2）：113-125.

［12］Herrmann M，Veres T，Tabrizian M.Enzymatically-generated fluorescent detection in micro-channels with internal magnetic mixing for the development of parallel microfluidic ELISA[J].Lab on a Chip，2006，6（4）：555-560.

［13］Jordan A.Nanotechnology and consequences for surgicaloncology[J].Kongressbd Dtsch Ges hit Konger，2002，119：821-828.

［14］Yi D K, Kim D Y.Polymer nanosphere lithography：fabrication of an ordered trigonal olymeric nanostructure[J].Chemical communications （Cambridge， England），2003：982-983.

［15］Taubert H，Blumke K，Bilkenroth U，et al.Detection of disseminated tumor cells in peripheral blood of patients with breast cancer：correlation to nodal status and occurrence of metastases[J].Gynecologic Oncology，2004，92：256-261.

［16］Nam J M，Thaxton C S，Mirkin C A.Nanoparticle-based biobar codes for the ultrasensitive detection of proteins[J].Science，2003，301：1884-1886.

［17］Nakamura T，Yasumura T，Hayashi K，et al.Immunocytochemical detection of circulating esophageal carcinoma cells by immunomagnetic separation [J].Anticancer research， 2000，20（6）：4739- 4744.

［18］王晓光，胡红，刘又宁.应用纳米免疫磁珠检测早期肺癌循环血中肿瘤细胞[J].中华医学杂志，2004，84（16）：1393-1395.

［19］Chen X M，Chen G Y，WANG Z R，et al.Detection of micrometastasis of gastric carcinoma in peripheral blood circulation[J].World Journal of Gastroenterology，2004，10（6）：804-808.

［20］Yao F，Guo J M，Xu C F，et al.Detecting AFP mRNA in peripheral blood of the patients with hepatocellular carcinoma，liver cirrhosis and hepatitis[J].Clinica Chimica Acta，2005，361（1-2）：119- 127.

［21］徐勇，李楠.纳米技术在生物医学上的应用[J].材料导报，2007，5（21）：11-13.

［22］Yan G H, Xing D, Tan S, et al.Rapid and sensitive immunomagneticelectrochemiluminescent detection of p53 antibodies in human serum[J].Journal of Immunological Methods，2004，288（1-2）：47- 54.

［23］张宝亮，张秋禹，张和鹏，等.负载高密度乙肝检测探针磁珠的制备及性能[J].高等学校化学学报，2011，32（5）：1070-1076.

［24］李成德，岑丽莲，陈金强，等，磁珠分离纯化技术在实时荧光定量PCR检测HBV DNA中的应用[J].现代检验医学杂志，2011，26（3）：68-71.

［25］van Helden J， Denoyel G， Freeman J， et al.Performance of a new HIV 1/o/2 assay on the Bayer ADVIA Centaur immunoassay system[J].Clinical Laboratory，2004，50：83-90.

［26］Barletta J，Bartolome A，Constantine N.Immunomagnetic quantitative immuno-PCR for detection of less than one HIV-1 virion[J].Journal of Virological Methods，2009，157（2）：122-132.

［27］陈庆森，冯永强，黄宝华，等.食品中致病菌的快速检测技术的研究现状与进展[J].食品科学，2003，24（11）：148-152.

［28］Gehring A，Irwinp P，Reed S，et al.Enzyme-linked immunomagnetic chemiluminescent detection of Escherichia coli O157：H7[J].Journal of Immunological Methods，2004，293（1-2）：97-106.

［29］Notzon A，Helmuth R，Bauer J.Evaluation of an immunomagnetic separation-real-time PCR assay for the rapid detection of Salmonella inmeat[J].Journal of Food Protection，2006，69（12）：2896-2901.

［30］Hudson J A，Lakc R J，Savill M G，et al.Rapid detection of Listeria monocytogenes in hair samples using irnrnunornagnetic separation followed by polymerise chain reaction[J].Applied Microbiology，2001，90（4）：614-621.

［31］Alefantis T，Grewal P，Ashton J，et al.A rapid and sensitivemagnetic bead-based immunoassay for the detection of staphylococcal enterotoxin B for high-through put screening [J].Molecular and Cellular Probes，2004，18（6）：379-382.

［32］Metzger-Boddien C， Khaschabi D， Schonbauer M，et al.Automated high-throughput immunomagnetic separation-PCR for detection of Mycobacterium avium subspparatuberculosis in bovinemilk[J].International Journal of Food Microbiology，2006，110（3）：201-208.

［33］Liu G M，Han Y L，Li X，et al.Applicability of a rapid method based on immunomagnetic capture-fluorescent PCR assay for Campylobacterjejuni[J].Food Control，2006，17（7）：527-532.

［34］苏惠玉，谢荣珍，牛建军.免疫磁珠捕获结合荧光PCR 技术检测食品中黄曲霉菌的研究[J].食品科学，2010，31（10）：287-291.

［35］Kapperud G，Vardunt T，Skjerev E，et al.Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica in foods and water by immunomagnetic separation，nested poly-merase chain reactions，and colorimetric detection of amplified DNA[J].Applied and Environmental Microbiology，1993， 59：29-38.

［36］Gilpatrick S G，Schwab K J，Estesm K，et al.Development of an immunomagnetic capture reverse transcription-PCR assay for the detection of Norwalk virus.Journal of Virological Methods，2000，90（1）：69-78.

［37］Lee J，Deininger R.Detection of E.coli in beach water within 1 hour using immunomagnetic separation and ATP bioluminescence[J].Luminescence，2004，19（1）：31-36.

［38］张凡非，杉山宽治，西尾智裕，等.环境样品中病原性副溶血性弧菌高效检出法[J].中国卫生检验杂志，2002，12（3）：272-274.

［39］张凡非，杉山宽治，西尾智裕，等.利用免疫磁珠法分离环境及食品中产生TDH副溶性弧菌的研究[J].中国卫生监督杂志，2004，11（1）：7-9.

［40］Islam D，Lindberg A A.Detect ion of Shigella dysenteriae type 1 and Shigella flexneri in feces by immunomagnetic isolation and polymerase chain reaction [J].Journal of Clinical Microbiology，1992，30（11）：2801-2806.

［41］李凤仪，张符光，李君文，等.三种固相抗体特异浓集水中F2a志贺氏菌的实验观察[J].工业卫生与职业病，1997，23（2）：102-104.

［42］Hulten K，Han S W, Enroth H，et a1.Helicobacter pylori in the drinking water in Peru[J].Gastroenterology，1996，110（4）：1031-1035.

［43］张彤，胡洪营，宗祖胜.免疫磁性分离法检测水中孢子虫和加的鞭毛虫的影响因素[J].环境与健康杂志，2007，24（1）：56-58.

［44］李训德，BRASSEUR Philippe.水体中隐孢子虫卵囊得检出极其活力分析[J].应用与环境学报，2003，9（1）：32-35.

［45］Mahbubani M H，Schaefer III F W，Jones D D，et a1.Detection of Giardia in Environmental Waters by Immuno-PCR Amplification Methods[J].Current Microbiology，1998，36（2）：107-113.

［46］杨万，何苗，李丹，等.免疫磁珠分离与实时定量PCR 技术联合检测水中轮状病毒的研究[J].环境科学，2009，30（5）：1368-1375.

［47］胡寅，沈国清，朱鸿林，等.有机磷农药纳米磁珠酶免分析方法研究[J].环境污染与防治，2010，32（9）：41-45.

［48］阚春月，衣杰荣，王守法，等.免疫磁珠结合RT-PCR检测黄瓜绿班驳花叶病毒[J].上海农学报, 2010, 26（4）：43-47.

［49］邓丛良，江明，汪万春，等.应用MNP-RT-PCR方法检测黄瓜绿斑驳花叶病毒[J].植物病理学报，2008，38（4）：436-440.

［50］邓丛良，江明，聂棱，等.应用MNP-Realtime-RT-PCR技术检测南芥菜花叶病毒[C].中国植物病理学会2008年学术年会，2008-07-01.

［51］孙宁，邓丛良，么磊，等.应用细菌磁颗粒实时荧光RTPCR检测南瓜花叶病毒[J].植物病理学报，2010，40（6）：632-635.

［52］陈定虎，邓丛良，李明福，等.运用纳米磁珠技术结合RT-PCR方法检测李痘病毒[J].植物检疫，2010，24（3）：17-19.