以金黄色葡萄球菌致病因素为靶点的免疫疗法研究进展

王晓丽，尹建永，瞿洪平

金葡菌是引起皮肤和软组织感染的主要病原菌，严重感染者可引起致命性的肺炎、血流感染、感染性心内膜炎以及化脓性关节炎和骨髓炎等。2011年中国CHINET细菌耐药性监测结果显示，临床分离的革兰阳性菌中金葡菌检出率最高，占35.6%，其中耐甲氧西林金葡菌（MRSA）的平均检出率高达50.6%［1］。研究发现万古霉素、利奈唑胺、达托霉素以及替加环素等新型抗菌药物的使用并没有明显降低金葡菌和MRSA的感染率及病死率，相反由于抗生素的选择压力可导致病原菌的耐药性进一步增高，已有报道万古霉素对MRSA的最低抑菌浓度（MIC）发生漂移［2］。因此，寻找新的抗感染辅助和替代疗法显得尤为重要。了解金葡菌生长、新陈代谢、毒力表达等致病机制，针对这些致病因素的免疫疗法是目前临床研究热点。

近年来，免疫疗法在金葡菌感染的动物实验和前期临床试验中取得进展。其中，表达金葡菌抗原的灭活疫苗可通过主动免疫提高机体免疫应答能力，而被动免疫抗体主要通过抑制金葡菌黏附能力、中和细菌外毒素等方式降低病原菌的致病性并延缓耐药基因产生，有效预防和治疗金葡菌感染。现将近年来以金葡菌致病因素为靶点的免疫疗法研究进展作一综述。

一、针对黏附性基质分子表面识别因子（MSCRAMMs）的免疫疗法

MSCRAMMs是金葡菌细胞壁相关的表面黏附素，通过分选酶（sortase）识别其保守的LPXTG（L亮氨酸、P脯氨酸、X任何氨基酸、T苏氨酸、G甘氨酸）基序而锚定在细胞壁肽聚糖上，可以识别宿主细胞外基质成分如纤维蛋白原和纤连蛋白等，使金葡菌定植、侵袭宿主组织细胞并逃避机体免疫应答。此外，MSCRAMMs与慢性感染中生物膜的形成有关［3］。金葡菌的MSCRAMMs包括20多种致病因子，目前研究较多的MSCRAMMs成分有凝集因子A和B、胶原黏附素、铁调控表面决定因子A和B、表面蛋白A、纤连蛋白A和B以及丝氨酸天冬氨酸重复蛋白D、E和G等［4］。

（一）凝集因子A 凝集因子A可介导金葡菌结合纤维蛋白原。研究发现凝集因子A能促进血浆中的细菌聚集，并使金葡菌黏附在导管、受损的血管壁和心脏瓣膜，从而导致感染性心内膜炎发生。动物实验发现，与未接种组相比，接种凝集因子A疫苗组小鼠感染金葡菌后体质量下降缓慢，化脓性关节炎的严重程度较轻（P＜0.006），30 d后病死率亦较低（13%和47%）。进一步研究表明，注射凝集因子A抗体能有效降低化脓性关节炎以及脓毒血症的病死率（37%和78%，P＜0.003）［5］。然而凝集因子A在临床试验中的结果却并不乐观。Aurexis○R是对凝集因子A有高效亲和力的抗体，一项有60例血流感染患者参与Ⅱ期临床研究发现，万古霉素联合Aurexis○R（20 mg／kg）治疗并未明显降低血流感染复发率、并发症以及病死率［6］。Veronate○R是基于凝集因子A和丝氨酸天冬氨酸重复蛋白G的多克隆IgG抗体，Ⅱ期临床试验证实，注射高剂量Veronate○R的新生儿感染发生率较低（2.5%和7.0%），但随后在脓毒症患者的Ⅲ期临床试验中，抗体注射组和安慰剂组感染发生率差异无统计学意义（6%和5%，P＞0.05）［4］。因此，凝集因子 A 疫苗和抗体的应用时机和剂量选择需要更多临床研究。

（二）铁调控表面决定因子 金葡菌的铁调控表面决定因子抗原可摄取和转运宿主血红蛋白和肌红蛋白中的铁元素，在铁缺乏的环境中其表达增加。哺乳动物的组织和血液是低铁环境，在金葡菌感染时铁调控表面决定因子抗原表达上调［7］。Ebert等［7］研究表明，金葡菌感染前2 h注射铁调控表面决定因子B抗体可有效发挥预防作用，使脓毒症小鼠生存率增高（P＝0.004）；在中央静脉导管模型中，注射铁调控表面决定因子B抗体可以减少细菌在导管上定植，降低血流感染发生率；但其治疗作用不明显，感染1 h后注射抗体仅轻微改善小鼠生存率（P＝0.30）。Merck V710○R是针对铁调控表面决定因子B的临床疫苗，多中心、双盲Ⅰ期临床试验证实，注射30～90μg该疫苗10～14 d后，志愿者体内可发生抗菌免疫应答［8］，但Ⅱ／Ⅲ期临床试验结果分析显示，Merck V710○R没有明显的保护作用，并且患者病死率和多器官功能障碍发生率较高，因而目前已终止对 Merck V710○R的研究（www.european pharmaceuticalreview.com／7547／news）。

二、针对细菌毒素和毒素分泌机制的免疫疗法

在感染过程中，由金葡菌分泌到细胞外的毒素也在其致病中发挥重要作用，因此通过中和细胞外毒素以及调控毒素分泌等方式可降低金葡菌的致病性。目前在金葡菌中研究较多的有a－溶血素、超抗原家族中的肠毒素和中毒性休克毒素、杀白细胞素［4］，这些毒力因子的分泌主要受到附属基因调节（agr）群体感应系统调控。

（一）a－溶血素 金葡菌分泌的a－溶血素是促进细胞溶解的成孔毒素。Adhikari等［9］研究发现，基于a－溶血素结构的AT－62aa疫苗可以使小鼠感染金葡菌后血流感染以及肺炎发生率明显降低（P＜0.05），减少细菌播散以及脓毒症的发生。进一步研究发现，注射AT62－IgG抗体可有效中和毒素，抑制a－溶血素聚合体形成，感染12 h后小鼠血液、脾脏、肾脏和肺组织中细菌负荷量下降；AT－62aa对脓毒血症和肺炎预防作用的临床试验正在进行中。

（二）超抗原家族 金葡菌的肠毒素和中毒性休克毒素等超抗原可以通过抗原提成细胞与T细胞受体交联偶合，导致T细胞增殖以及大量细胞因子释放，导致中毒性休克综合征的发生。研究表明，灵长类动物暴露于金葡菌肠毒素B气溶胶后可引起胃肠道症状、嗜睡、休克甚至死亡。注射金葡菌肠毒素B抗体可起到免疫保护作用［10］。Hu等［11］研究发现，免疫接种灭活中毒性休克毒素－1疫苗可提高感染小鼠生存率并降低各组织器官中细菌负荷量；注射中毒性休克毒素－1抗体可抑制INF－γ和TNF－α等致病因子的表达。目前，金葡菌肠毒素B疫苗在中毒休克综合征中的预防作用的Ⅰ期临床试验（NCT00974935）正在进行中（http：／／clinicaltrials.gov／ct2／show／NCT00974935）。

（三）杀白细胞素 杀白细胞素由LukS和LukF蛋白组成，是能够促进中性粒细胞溶解的成孔毒素，研究发现CA－MRSA分泌的杀白细胞素与皮肤和软组织感染相关。Brown等［12］研究发现，杀白细胞素疫苗在小鼠肺炎和皮肤感染中发挥保护作用。但在临床试验中，Hermos等［13］研究发现，杀白细胞素抗体在儿童初次或复发的皮肤软组织感染中并不能起到保护作用，甚至可能增加感染风险。

（四）agr群体感应系统 金葡菌agr群体感应系统可调控多种毒素和胞外酶的表达，合成并释放群体感应分子自体诱导肽（AIPs）可以监测自身浓度以及周围环境中细菌数量变化，当达到一定浓度阈值时，能启动菌体中相关致病基因表达。近年来，agr系统及AIPs被作为免疫治疗靶点。研究表明AIPs－4的单克隆抗体AP4－24H11可以降低agr效应分子RNAⅢ表达，使金葡菌致病性下降，抑制小鼠脓肿形成，并提高感染小鼠生存率［14］。但也有研究发现，agr抑制剂在下调某些毒力因子的同时可上调某些agr反向调控因子如SpA的表达，造成金葡菌黏附定植能力以及生物被膜的形成增加［15］。因此，目前agr抑制剂的应用尚存在争议，关于agr系统在金葡菌中的致病机制和能否作为免疫治疗靶点仍需进一步研究。

三、针对荚膜多醣体的免疫疗法

包裹金葡菌的荚膜可阻碍抗体和金葡菌表面蛋白的接触，从而限制抗体介导的调理吞噬作用，临床菌株中5型和8型荚膜多糖最常见。动物实验发现采用单价5型荚膜多糖疫苗免疫小鼠，感染后实验组存活率明显高于磷酸盐缓冲盐水接种组（73%和13%）［4］。采用5型荚膜多糖或8型荚膜多糖抗体治疗的小鼠感染4 d后各种组织内细菌负荷量均明显降低（P＜0.001）［16］。目前，针对荚膜多糖体的临床研究结果尚有争议。StaphVAX○R是基于5型荚膜多糖、8型荚膜多糖的疫苗，研究发现Staph－VAX○R可使血液透析患者金葡菌血流感染的发生率下 降 57%［4］；AltaStaph○R是针对 StaphVAX○R的抗体，206例低体质量新生儿分别给予AltaStaph○R和安慰剂治疗，结果两组血流感染的发生率的差异无统计学意义；另外一项Ⅱ期临床实验，40例血流感染且持续高热患者随机分组给予AltaStaph○R和标准治疗，两组的病死率分别为23%和11%，差异无统计学意义（P＝0.42）［15］。

四、针对ABC运载体的免疫疗法

ABC运载体是位于细胞膜和细胞壁之间或者内膜中的一类保守脂蛋白，主要参与细菌营养物质摄取和生物被膜的形成，并参与抗菌药物泵出机制使细菌耐药性增强。Brady等［17］在动物实验中发现，采用ABC运载体疫苗联合万古霉素治疗慢性骨髓炎，临床感染症状和影像学感染表现分别下降67%和82%，其中87.5%的生物膜可以被完全清除，而单独使用抗菌药物或疫苗均不能有效清除感染。Ⅱ期临床试验中证实ABC运载体抗体Aurograb○R

可以增加金葡菌对万古霉素的敏感性，但是在治疗难治性金葡菌感染的Ⅲ期试验中，Aurograb○R联合万古霉素治疗没有达到预期疗效［15］。

五、针对脂磷壁酸的免疫疗法

脂磷壁酸是革兰阳性菌独有的等离子膜镶嵌聚合体。早期研究表明，脂磷壁酸可以与CD14和TLR2受体结合，激活NF－κB通路，在关节炎、脑膜炎以及肾炎的致病中发挥重要作用。研究表明，采用脂磷壁酸抗体可以促进血流感染中细菌清除，减少腹膜炎模型中小鼠的病死率［18］。Pagibaximab○R是针对脂磷壁酸的疫苗，Ⅰ／Ⅱ期临床试验证实其可以降低低体质量新生儿血流感染的发生率［19］。目前评估 Pagibaximab○R对金葡菌脓毒血症的防治作用的Ⅱ／Ⅲ期试验已完成。

六、针对 N－乙酰－B－1，6－葡萄糖胺（PNAG）的免疫疗法

金葡菌分泌的细胞外PNAG与生物膜的形成有关，可使致病菌逃避中性粒细胞的吞噬作用以及抗菌肽杀菌作用［20］。研究结果显示，注射脱乙酰基PNAG的兔血清抗体可以使小鼠血液中金葡菌清除率达到54%～91%［4］。目前PNAG抗体在铜绿假单胞菌等耐药菌感染中的保护作用已得到证实［21］。

动物实验中，以金葡菌细胞壁相关黏附蛋白、毒力因子等为靶点的免疫疗法可以降低金葡菌定植和感染。但是，目前尚无任何一种疫苗或抗体成功通过临床试验并应用于临床，这可能与多种因素有关［4，10］。首先，金葡菌抗原靶点的选择仍是现在面临的一大挑战，细菌生长的不同阶段抗原表达不同且易发生改变；同种感染的不同时相发挥主要致病作用的抗原也不同；对于不同类型的感染，致病的关键抗原亦不同，如a－溶血素和杀白细胞素较容易引起肺炎和皮肤软组织感染，而PNAG主要与有生物膜形成的慢性感染相关。其次，金葡菌具有复杂的免疫逃避机制。金葡菌分泌的免疫调控蛋白具有抑制补体激活、中性粒细胞趋化、抗体介导的调理作用以及中和抗菌防御肽等作用，如超抗原蛋白7、10可与IgA和IgG结合，抑制补体激活；此外金葡菌可持续存在于上皮细胞、内皮细胞以及成纤维细胞内形成胞内菌，逃避宿主的免疫应答。

七、结语

对于金葡菌感染，尤其抗菌药物治疗无效的多重耐药菌感染，越来越多的证据显示，疫苗主动免疫预防或抗体被动免疫治疗是一种可行的补充或替代治疗方法。因此，了解金葡菌复杂的致病因素与宿主免疫应答之间相互作用机制，寻找相对保守的免疫治疗靶点仍是今后努力研究的方向。此外，研制具有广谱靶点的疫苗和抗体［22］，针对金葡菌所致不同部位的感染，以及不同罹患人群选择合适的免疫疗法，可能使未来免疫治疗取得成功。

［1］ 胡付品，朱德妹，汪复，等.2011年中国CHINET细菌耐药性监测［J］.中国感染与化疗杂志，2012，12（5）：321－329.

［2］ Brink AJ.Does resistance in severe infections caused by methicillin－resistant Staphylococcus aureus give you the′creeps′？［J］.Curr Opin Crit Care，2012，18（5）：451－459.

［3］ Ythier M，Resch G，Waridel P，et al.Proteomic and transcriptomic profiling of Staphylococcus aureus surface LPXTG－proteins：correlation with agr genotypes and adherence phenotypes［J］.Mol Cell Proteomics，2012，11（11）：1123－1139.

［4］ Verkaik NJ，van Wamel WJ，van Belkum A.Immunotherapeutic approaches against Staphylococcus aureus ［J］.Immunotherapy，2011，3（9）：1063－1073.

［5］ Josefsson E，Hartford O，O′Brien L，et al.Protection against experimental Staphylococcus aureus arthritis by vaccination with clumping factor A，a novel virulence determinant［J］.J Infect Dis，2001，184（12）：1572－1580.

［6］ Weems JJ Jr，Steinberg JP，Filler S，et al.Phase II，randomi－zed，double－blind，multicenter study comparing the safety and pharmacokinetics of tefibazumab to placebo for treatment of Staphylococcus aureus bacteremia［J］.Antimicrob Agents Chemother，2006，50（8）：2751－2755.

［7］ Ebert T，Smith S，Pancari G，et al.A fully human monoclonal antibody to Staphylococcus aureus iron regulated surface determinant B（IsdB）with functional activity in vitro and in vivo［J］.Hum Antibodies，2010，19（4）：113－128.

［8］ Harro C，Betts R，Orenstein W，et al.Safety and immunogenicity of a novel Staphylococcus aureus vaccine：results from the first study of the vaccine dose range in humans［J］.Clin Vaccine Immunol，2010，17（12）：1868－1874.

［9］ Adhikari RP，Karauzum H，Sarwar J，et al.Novel structurally designed vaccine for S.aureus alpha－hemolysin：protection against bacteremia and pneumonia［J］.PLoS One，2012，7（6）：e38567.

［10］ Proctor RA.Is there a future for a Staphylococcus aureus vaccine？［J］.Vaccine，2012，30（19）：2921－2927.

［11］ Hu DL，Omoe K，Sasaki S，et al.Vaccination with nontoxic mutant toxic shock syndrome toxin1 protects against Staphylococcus aureus infection［J］.J Infect Dis，2003，188（5）：743－752.

［12］ Brown EL，Dumitrescu O，Thomas D，et al.The Panton－Valentine leukocidin vaccine protects mice against lung andskin infections caused by Staphylococcus aureus USA300［J］.Clin Microbiol Infect，2009，15（2）：156－164.

［13］ Hermos CR，Yoong P，Pier GB.High levels of antibody to panton－valentine leukocidin are not associated with resistance to Staphylococcus aureus－associated skin and soft－tissue infection［J］.Clin Infect Dis，2010，51（10）：1138－1146.

［14］ Park J，Jagasia R，Kaufmann GF，et al.Infection control by antibody disruption of bacterial quorum sensing signaling［J］.Chem Biol，2007，14（10）：1119－1127.

［15］ Ohlsen K，Lorenz U.Immunotherapeutic strategies to combat staphylococcal infections［J］.Int J Med Microbiol，2010，300（6）：402－410.

［16］ Tuchscherr LP，Buzzola FR，Alvarez LP，et al.Antibodies to capsular polysaccharide and clumping factor A prevent mastitis and the emergence of unencapsulated and small－colony variants of Staphylococcus aureus in mice［J］.Infect Immun，2008，76（12）：5738－5744.

［17］ Brady RA，O′May GA，Leid JG，et al.Resolution of Staphylococcus aureus biofilm infection using vaccination and antibiotic treatment［J］.Infect Immun，2011，79（4）：1797－1803.

［18］ Theilacker C，Kropec A，Hammer F，et al.Protection against Staphylococcus aureus by antibody to the polyglycerolphosphate backbone of heterologous lipoteichoic acid［J］.J Infect Dis，2012，205（7）：1076－1085.

［19］ Weisman LE，Thackray HM，Garcia－Prats JA，et al.Phase 1／2 double－blind，placebo－controlled，dose escalation，safety，and pharmacokinetic study of pagibaximab （BSYXA110），an antistaphylococcal monoclonal antibody for the prevention of staphylococcal bloodstream infections，in verylow－birth－weight neonates［J］.Antimicrob Agents Chemother，2009，53（7）：2879－2886.

［20］ Park B，Liu GY.Targeting the host－pathogen interface for treatment of Staphylococcus aureus infection［J］.Semin Immunopathol，2012，34（2）：299－315.

［21］ Ricard JD.New therapies for pneumonia［J］.Curr Opin Pulm Med，2012，18（3）：181－186.

［22］ Pozzi C，Wilk K，Lee JC，et al.Opsonic and protective properties of antibodies raised to conjugate vaccines targeting six Staphylococcus aureus antigens［J］.PLoS One，2012，7（10）：e46648.