肉毒杆菌及肉毒毒素研究进展

赵思俊，李雪莲，曹旭敏，王 娟，王玉东，王君玮，曲志娜

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.青岛易邦生物工程有限公司，山 东青岛 266032）

2013年8月4日，国家质量监督检验检疫总局通报了我国4家进口新西兰恒天然公司受“肉毒杆菌”污染乳制品的企业名单，食品安全，尤其是婴幼儿食品安全再一次引起人们高度关注。肉毒杆菌作为一种致命病菌，能引起肉毒中毒症，引起全社会的高度关注。现就肉毒杆菌及肉毒毒素的研究进展进行综述，以期为加强食品安全监管提供技术支持。

1 肉毒杆菌

肉毒杆菌（Bacillus botulinus），又称肉毒梭状芽胞杆菌（Clostridium botulinum），是一种革兰氏阳性厌氧芽孢菌，广泛分布于自然界中，其芽胞在江河湖海的淤泥沉积物、尘土和动物的粪便中都有存在，水和土壤中的芽胞，是造成食物污染的主要来源。厌氧环境中，该菌分泌强烈的肉毒毒素，能引起特殊的神经中毒症状，对人类和动物的致死率很高，是毒性最强的蛋白质之一。因此，这种毒素还可用于制造生化武器。

肉毒毒素（Botulinum neurotoxin，BoNT）最早是由E.van Ermengen在1897年调查比利时Ellezelles暴发的一次食源性传染性时发现[1]，随后，在世界各地都陆续报道过肉毒毒素中毒事件[2-4]。由于它具有厌氧生长、低温生长产毒的特点，使其在日益普及的真空包装、冷冻食品及罐装食品中具有生长优势，从而成为这类食品中毒的主要原因之一。

2 肉毒毒素——具有生物学意义的菌体产物

肉毒杆菌的致病性在于所产生的神经毒素——肉毒毒素，这些毒素能引起人和动物的肉毒中毒。根据肉毒毒素的抗原性，肉毒杆菌至今已有A、B、C（Cα和Cβ）、D、E、F、G等7个型，各型的肉毒杆菌分别产生相应型的毒素。其中，A、B、E、F型可引起人群中毒，C、D型毒素主要是畜、禽肉毒中毒的病原，对人不致病。G型肉毒杆菌极少分离，未见G型菌引起人群中毒报道。我国肉毒杆菌食物中毒大多是由A型引起的，其他型相对较少。

肉毒杆菌属于中温菌，生长最适温度25～37℃，产毒最适温度20～35℃，最适pH为6～8.2，当pH低于4.5和超过9时，温度低于15℃或超过55℃时，肉毒杆菌不能繁殖和形成毒素。另外，食盐能抑制该菌的生长和毒素的产生，但是不能破坏已形成的毒素。提高食品中酸度也能抑制该菌的生长和毒素的产生。

肉毒毒素是目前已知的化学毒物与生物毒素中毒性最强烈的一种，其小鼠LD50为0.00625 ng，少至0.1～1.0 μg的肉毒毒素就可导致人中毒死亡。肉毒毒素是一种大分子蛋白质，A、B、E、F各型毒素均含有两种蛋白质成分：神经毒素和无毒性的红细胞凝集素。结构研究表明：肉毒毒素由轻链（L链，氨基端，50 KDa）与重链（H链，羧基端，100 KDa）通过一个二硫键连接[5]。其中重链与肉毒毒素的受体特异结合有关，其羧基端分子量约50 KDa的片段（Hc）是肉毒毒素的受体结合区（RBD），存在受体结合位点[6]，但是对受体结合区哪些片段在与受体的相互作用中发挥关键作用还缺乏足够了解，研究还发现Hc片段是肉毒毒素的主要保护性抗原，含有中和性B细胞表位[7]。

肉毒毒素对消化酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶）、酸和低温很稳定，对碱和热敏感，易于被破坏失去毒性。在正常胃液中24 h尚不能将毒素破坏。故吃了含有毒素的食品，毒素可以被胃肠道吸收。各种肉毒毒素的致病性虽相同，但一种毒素只能被其产生的抗毒素所中和，无交叉免疫，这在抗毒素血清治疗上有重要意义。

3 肉毒毒素的致病机制

肉毒毒素的作用包括结合、定位和麻痹3个阶段[8]。一旦毒素与神经细胞受体或具有内吞作用的间接受体结合后，抗体就不能中和毒素。接着内涵体的酸性发生变化，启动毒素转运区域构象发生变化，同时囊泡腔在囊泡膜质子泵ATP酶作用下酸化，暴露出一个疏水区域，在膜上产生一个离子通道，L链通过此通道进入胞液。在胞内，毒素分解三种蛋白释放Ach，导致肌 肉松弛或痉挛麻痹[9]。

轻链和重链的N端结构由1个保守的二硫键连接，在二硫键存在的状态下，毒素重链HN结构域形成一条环形结构，将深陷于轻链表面裂缝中的锌离子催化部位遮蔽，从而不表现酶活性[10]。在双链毒素进入神经细胞后，二硫键被还原，释放出的轻链才能表现出酶活性，催化部位能够容纳底物16个氨基酸残基。与催化部位的锌离子形成配位键的除了2个组氨酸残基的咪唑环、1个结合于保守谷氨酸的水分子外，还有1个谷氨酸羧基，1个色氨酸分子也可能参与了配位。毒素轻链的这种独特的配位形式、空间结构与已知的金属蛋白酶并不相同，属于一个新型的金属蛋白酶家族[11]。

4 肉毒毒素中毒的主要类型

肉毒毒素中毒根据其传播途径不同可分为3个类型，分别是食源性肉毒毒素中毒、婴儿肉毒毒素中毒、创伤性肉毒毒素中毒[12-14]。在目前己知的病例中，食源性肉毒毒素中毒占绝对多数，其次是婴儿肉毒毒素中毒。

4.1 食源性肉毒毒素中毒

食源性肉毒毒素中毒主要是由于进食了含有肉毒毒素的食品所引起，也是人类肉毒毒素中毒最普遍的一种形式。

食品在制作过程中被肉毒杆菌芽孢所污染，制成后未彻底灭菌，芽孢可在厌氧环境中发芽繁殖、产生毒素，食前又未加热烹调，已产生的毒素被食后引起食物中毒，多见于罐头食品、乳制品、真空包装食品和冷冻食品等，在我国，肉毒中毒大多由发酵的豆制品和面制品所致。

4.2 婴儿肉毒毒素中毒

婴儿肉毒毒素中毒由于新生儿正常菌群缺乏，其食入的肉毒杆菌芽孢可以萌发、繁殖、产生毒素，从而引起婴儿中毒。

婴儿的发病年龄通常在2周到8个月，年龄在9个月以上的婴儿未见相关报道。婴儿中毒A型多于B型，F型极为罕见。1岁以下的婴幼儿不宜食用蜂蜜，因为蜜蜂在采集花粉酿蜜的过程中，很容易把被肉毒杆菌污染的花粉和蜜带回蜂箱，导致蜂蜜中含有的肉毒杆菌较多，容易引起婴儿肉毒毒素中毒。芽孢在人体内一般不能出芽，但由于婴儿肠道的特殊环境，可能引起感染和中毒。临床表现为先是便秘，继而出现头颈部肌肉软松、吮乳无力、吞咽困难、眼帘下垂、全身肌肉松弛减退，可持续8周以上。只要注意营养和护理，一般可在1-3月内自然恢复，严重者亦可因呼吸麻痹而导致婴儿猝死。婴儿肉毒病是肉毒杆菌感染后在体内繁殖产生毒素所致，属于感染性中毒，与单纯性中毒不同。

4.3 创伤性肉毒症

创伤性肉毒中毒，类似破伤风，由于伤口处污染的肉毒杆菌芽孢繁殖、产毒，毒素从伤口进入血液循环，随血流到达神经系统后引起肉毒中毒而导致。

5 肉毒毒素中毒的临床症状

肉毒中毒的临床表现与其他食物中毒不同，胃肠道症状少见，主要为运动神经末梢麻痹。临床表现包括因肌肉活动不协调而出现肢体歪斜，舌外伸，食物的取用、咀嚼、吞咽出现困难。意识正常，如果未出现继发感染，体温仍保持正常。

该病潜伏期18～72 h，先有一般不典型的乏力、头痛等症状，随后眼肌麻痹，开始出现复视、斜视、眼睑下垂等，后来发展至咽喉部肌肉麻痹，吞咽、咀嚼困难，进而隔膜麻痹、呼吸困难，重者可死于呼吸困难与衰竭，病死率在30%以上。

6 肉毒杆菌和肉毒毒素的检测方法

由于肉毒杆菌的致病性主要在于其产生的外毒素，并且由于肉毒杆菌属于厌氧菌，培养条件要求高，一般实验室不具备这样的条件，所以检测的重点主要是对肉毒毒素的检测。目前实验室中常用的检测肉毒毒素的方法是基于抗原抗体反应、针对毒素蛋白的检测，还有小鼠致死及中和实验、胶体金免疫层析法等，另外，也有少量采用分子生物学方法检测肉毒毒素基因的报道[15-18]。

6.1 肉毒杆菌的厌氧分离培养与鉴定

将可疑食物或呕吐物煮沸1 h可以杀灭非芽胞杆菌，接种于血琼脂平板厌氧培养；或将可疑材料在65～80℃条件下加热30 min，然后37℃培养24 h，涂片检查细菌形态，并作生化鉴定。对于E型菌的芽孢还需要用溶菌酶处理，用血琼脂平板在厌氧条件下培养。根据生化反应和毒素的产生进行鉴定，可采用免疫荧光方法鉴定某些代谢群的菌株，还可编码各种毒素的基因设计引物进行PCR扩增。

6.2 小鼠毒素中和试验

对于传统的检测方法，小白鼠腹腔注射法是目前对肉毒毒素活性与定性的标准分析方法。该方法灵敏度高，但检测周期长，至少需要4天；另外还存在使用实验动物带来高成本的缺点，同时需要较复杂的实验操作。因而，近年来主要研究利用被动血凝反应测定、放射免疫测定、凝胶扩散测定、酶联免疫测定、肽链内切酶酶联免疫测定等，大多采用免疫法，检测单个样品的时间可以缩短到几个小时。由于免疫法主要基于分子识别，在肉毒毒素失活或部分失活的情况下，也可能检出。也就是说，免疫方法只能测定是否存在肉毒毒素分子，而不能测定其活性，在测定活性或毒力时，仍需要采用小白鼠腹腔注射法。

6.3 其他检测方法

康彦等[19]采用毛细管电泳激光诱导荧光检测联用技术分离检测肉毒毒素A与其人工合成多肽底物反应后的产物来对其活性进行分析，该方法具有需要样品量少，分析速度快等优点。苏裕心等利用SmartCycler系统，建立了一种高敏、特异、简便、快速的检测肉毒杆菌等多种食源性致病菌的荧光定量PCR方法[20]。

近年来，基因芯片法以其具有集成化、微型化、自动化、高通量等特点，被广泛用于病原菌的检测。金大智等[21]以16S rDNA和23S rDNA基因作为检测靶片段，选取15种常见肠道致病菌作为基因芯片检测的靶细菌，设计和筛选通用性引物和特异性探针，优化两重PCR反应体系，并探讨核酸提取方法、引物不对称比例、镁离子浓度、退火温度、退火时间、杂交温度、杂交液成分等因素对基因芯片杂交的影响。成功建立了包括肉毒杆菌在内的15种肠道致病微生物的基因芯片检测法，并用于临床诊断。

7 肉毒毒素的预防和治疗

肉毒毒素的防治，主要采用疫苗预防和使用保护性抗体进行被动免疫治疗。疫苗是预防肉毒中毒的最有效的方法。临床诊断往往不能有效区分中毒的肉毒毒素类型，治疗时多使用多价的马血清抗毒素[22-23]。

7.1 肉毒毒素疫苗

目前肉毒毒素疫苗的类型主要有：肉毒毒素的类毒素疫苗、肉毒毒素亚单位疫苗、肉毒毒素的DNA疫苗等。目前国外使用较多的肉毒毒素的类毒素疫苗是福尔马林灭活的五价疫苗。但该疫苗只含有七个血清型中的5种（A-E），不能抵抗F和G型肉毒毒素的攻击[24]。研究表明，肉毒毒素的Hc片段包含保护性抗原基本决定簇，作为免疫原能引发显著保护性免疫应答，A和B型毒素Hc重组蛋白的高效表达也有一定的进展[25-26]。

7.2 肉毒毒素的治疗

7.2.1 肉毒毒素拮抗剂：小分子化合物和肽类物质对肉毒毒素的毒性可以起到一定的抑制作用，毒素拮抗剂成为肉毒毒素中毒防治的新途径[27-28]。

肉毒毒素拮抗剂的靶目标主要是：1）胆碱能运动神经末端的表面结合位点。肉毒毒素的H链首先与胆碱能神经末梢的突触前膜上的受体结合；2）毒素的中和抗原表位；3）毒素轻链的活性部位。阻断毒素与胆碱能运动神经末端受体的结合相对困难，与之相比，抑制毒素与中和抗原表位的结合显得更加有效，能够延缓机体死亡，而不能有效防治瘫痪。研究发现，一些锌离子试剂、金属蛋白酶抑制剂等可以抑制肉毒毒素轻链的活性。

7.2.2 肉毒毒素抗毒素：常用的方法是以福尔马林类毒素免疫小鼠以制备单克隆抗体，然而研究表明无论作为免疫原或抗原，肉毒毒素类毒素和毒素之间存在显著的差异。目前，研究者正致力于新型抗毒素的研究。Cenci[29]以体外表达肉毒毒素轻链片段为免疫原制备鼠单克隆抗体，虽然在体内不能抑制毒素的毒性，但是可以防止毒素引起的神经递质释放的抑制。Pless等[30]用毒素Hc片段制备了单克隆抗体，从而确定了A型肉毒毒素的Hc中至少有2个不同的中和抗原表位。其他研究也表明用单抗封闭毒素Hc上的表位，也可在一定程度上有效预防和治疗肉毒毒素中毒。

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