昆虫病原线虫大量培养技术研究

田会鹏，梁洪柱，李学燕，陈倩，宁少华，侯峥嵘

(北京市西山试验林场，北京 100093)

昆虫病原线虫寄主范围广，具有主动搜索能力、高杀虫力，对人畜、环境安全，能够人工大量培养等优点，是害虫生物防治中很有潜力的类群［1-3］。因此，用昆虫病原线虫防治农林及牧草害虫受到国内外学者及生产厂家的广泛重视［4-5］。目前，美国、德国、澳大利亚、荷兰、加拿大等国家的数十家商业化公司均可提供生产上应用的昆虫病原线虫［6］。

在昆虫病原线虫生防产品的生产中，线虫的大量繁殖是制约其商品化的瓶颈之一，由于昆虫病原线虫三角瓶培养过程繁琐、占用空间大、产量小等原因导致生产成本过高，在市场上无法与价格相对低廉的化学农药竞争［7-8］。本研究设计制造了昆虫病原线虫不锈钢培养盒，试图通过增加装量来提高线虫产量，降低生产成本。

1 材料与方法

1.1 材料 线虫Steinernema carpocapsae A24和其共生菌Xenorhabdus nematophila。

培养容器为不锈钢培养盒，35 cm×25 cm×20 cm，侧面靠上部开突出圆口，可用纱布封口，以满足培养过程产生的CO2、氨等不良气体的排出。

共生菌培养液为牛肉膏、蛋白胨、蒸馏水等。

固体培养基(已申请专利保护)成分主要有黄豆粉、面粉、蛋黄粉、蛋白胨、海绵、水等。

混合好的固体培养基分别以800，1 000，1 200，1 400 g/盒的量装入培养盒中;以装量80 g/瓶的500 mL三角瓶作为对照，121℃灭菌45 min后待用。1.2 接种方法 将Xenorhabdus nematophila接入共生菌培养液，摇床振荡培养48 h。以0.1 mL/g的量接入配置好的线虫固体培养基中，在25℃培养3 d后，以500条/g的量接入线虫悬浮液，定期取样检测线虫发育进程［9］，培养21 d后收获线虫，不同处理重复4次。

1.3 分析方法

1.3.1 线虫数量检测 将盒内培养好的线虫连同共生菌和培养基浸泡于清水，线虫通过筛网沉降出来，多次漂洗至无杂质。再把线虫稀释若干倍后，摇匀，取1mL稀释液在解剖镜或光学显微镜下计数，取平均值。

1.3.2 线虫侵染力的测定 采用沙埋法，将单头健康高龄大蜡螟Galleria mellonella幼虫放入塑料盒中，每盒放入消毒细沙80 g，滴入含100条侵染期线虫的悬液，25℃条件下放置24 h后取出大蜡螟，转置于25℃恒温室，24 h后取出大蜡螟死虫，解剖，用解剖镜检查进入虫体内的线虫数量，计算侵染率。当线虫的侵染率在7% ～10%左右，可认为线虫的质量较好。

2 结果与分析

2.1 不同处理对线虫产量的影响 在培养后第22 d收获并统计侵染期(IJ)线虫的产量，通过图1可以看出，800，1 000 g/盒2种处理中昆虫病原线虫产量较高，每克培养基线虫含量均超过4.2×105条，1 000 g/盒处理与对照之间无显著差异;而1 200 g/盒、1 400 g/盒2种处理每克培养基线虫含量均低于3.6×105条，彼此间无显著性差异，但同800 g/盒、1 000 g/盒、对照处理间差异显著。

图1 不同处理对线虫产量的影响

2.2 不同处理对线虫整齐度的影响 线虫整齐度是考核线虫规模化生产成功与否的重要因子，只有整齐度高，在应用时才能达到理想的防治害虫的效果。收获的IJ线虫的整齐度见图2。5个处理的线虫整齐度均高于96%，其中800 g/盒，1 000 g/盒 2个处理与对照的线虫整齐度超过98%。

2.3 不同处理对线虫发育进程的影响 在不同处理上各代线虫的发育进程存在差异，其中800 g/盒、1 000 g/盒处理的发育进程较快，1 200 g/盒处理与对照发育历期一致，1 400 g/盒处理中的接种代、F1代发育历期与1 200 g/盒处理及对照一致，F2代的发育进程最慢。详见表1。

图2 不同处理对线虫整齐度的影响

表1 不同处理各代线虫发育历期的差异

2.4 不同处理对线虫侵染力的影响 侵染力反映线虫的毒力，是昆虫病原线虫质量主要的评价指标。不同处理培养的线虫对大蜡螟的侵入能力测定结果表明:800，1 000，1 200 g/盒3个处理中线虫的侵染率分别为 11.26%，12.32%，10.30%，与对照的11.77%无显著差异，侵染能力较强;1 400 g/盒处理(5.21%)与800，1 000，1 200g/盒、对照 4 个处理相比差异达到显著水平(P＜0.05)。

3 讨论

试验发现800 g/盒、1 000 g/盒 2个处理在线虫产量、线虫整齐度、线虫发育进程、线虫侵染力方面都较好，与500 mL三角瓶的对照培养效果接近，从生产角度，同样体积的培养盒尽可能多的培养线虫考虑［10］，确定培养物装量为1 000 g/盒最为理想，这个装量是500 mL三角瓶装量的12.5倍，线虫培养效率提高很大，其最佳培养时间为18 d，比同样条件下三角瓶培养缩短了2 d，且线虫侵染力与三角瓶培养无显著差异。

使用此方法进行昆虫病原线虫的大量培养，提高了线虫培养效率，节约了人工成本，有利于昆虫病原线虫的推广使用。

［1］ 朱明军，韩日畴，吴振强，等.斯氏线虫生物反应器液体培养的初步研究［J］.华南理工大学学报，1999，27(3):83-87.

［2］ 游娟，梁世中，韩日畴.昆虫病原线虫共生细菌胞内晶体蛋白的研究进展［J］.昆虫天敌，2005，27(2):76-82.

［3］ 王立霞，杨怀文，黄大昉.昆虫病原线虫共生细菌致病机理的研究进展［J］.微生物学报，2000，40(4):448-451.

［4］ 吕昌仁，冯善斌.应用昆虫病原线虫防治意杨桑天牛的初步研究［J］.湖北林业科技，1995(2):35-36.

［5］ 杨秀芬，杨怀文.嗜线虫杆菌接菌量对小卷蛾线虫产量的影响［J］.中国生物防治，1997，13(4):163-165.

［6］ Kaya H K，Gaugler R.Entomopathogenic nematodes［J］.Annual Review of Entomology，1993，38:181-206.

［7］ 李慧萍，韩日畴.昆虫病原线虫感染寄主行为研究进展［J］.昆虫知识，2007，44(5):637-642.

［8］ 董围伟，刘贤进，余向阳，等.昆虫病原线虫研究概况［J］.昆虫知识，2001，38(2):107-111.

［9］ 曾善玉，简恒，张善稿，等.不同培养基对线虫质量影响的统计分析［J］.数理统计与管理，1996，15(3):9-12.

［10］ 潘洪玉，丁利，王迎春，等.昆虫病原线虫培养基的筛选和改进［J］.吉林农业大学学报，1995，17(4):16-19.