实验性牙周炎动物模型的研究进展

李 婧，娄晋宁，徐宝华★

（1.中日友好医院 口腔医学中心；2.中日友好临床医学研究所，北京 100029）

牙周炎是指发生在牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质的炎症性、破坏性疾病，是人类最古老、最普遍的疾病之一，其发病率在60%～90%，是造成成年人牙齿丧失的主要原因之一[1]。 本文就近年来国内外实验性牙周炎动物模型建立的概况作一综述。

1 牙周炎发生的基本条件

牙周炎是菌斑微生物引起的感染性疾病，菌斑微生物是引发牙周炎的始动因子，是造成牙周炎破坏的必需因素。牙菌斑中存在少量致病菌，它能破坏宿主的防御能力，引发牙周组织的破坏。宿主自身的易感性在牙周炎的发生发展过程中也起着十分重要的作用，包括遗传因素、性激素水平、全身免疫状态、系统性疾病等都会影响宿主的防御功能，影响牙周炎的发生。

2 实验模型动物的选择

牙周炎易感动物种属很多，选择合适的实验动物对于牙周炎动物模型的建立起到至关重要的作用。可用于建立牙周炎模型的实验动物有：非人灵长类（如猴）、狗、大鼠、仓鼠、兔、小型猪、家养雪貂及马等[2]。通常需根据实验目的以及实验室条件选择实验动物。猴及狗这类存在伦理学及社会学问题的大型动物通常是在新的治疗方法用于临床治疗前的最后阶段才考虑使用。大多数情况下，大鼠或仓鼠这类小型动物能够满足评价细菌、饮食或其他因素在牙周炎症的组织学水平上的作用，能够充分的体现统计学差异，满足临床前试验参考的需要。

3 牙位的选择

牙周病损的发生具有部位特异性，牙周炎最易受累的牙位为下颌切牙和上颌磨牙，其次是下颌磨牙、尖牙和上颌切牙、前磨牙，最少受累的为上颌尖牙和下颌前磨牙。因此，在选择实验牙时多数学者选择相对稳定的磨牙区为实验牙，也有学者为便于观察实验结果而选择下前牙。

4 牙周炎动物模型的构建方法

4.1 非人灵长类

非人灵长类其口腔及牙齿结构与人类极为相似，可以自发地形成牙菌斑、牙石、口腔微生物致病菌，是牙周疾病病因学及免疫微生物学研究最适合的模型动物，也是使用生物学材料进行牙周病治疗研究的极佳模型动物。

恒河猴、猕猴及狒狒，对牙周疾病有天然的易感性[3]。为了加速牙周炎的进展，常用丝线、尼龙线或正畸弹力圈等结扎或缝合于实验牙颈部，促进菌斑形成，每隔1～2周更换结扎材料，直到探诊证实牙周袋形成。非人灵长类还被用于接种人类牙周致病菌。将从未接触过人类牙周致病菌的猕猴接种牙龈卟啉单胞菌（porphyromonas gingivalis，Pg），约5个月后证实该动物感染Pg，可见牙槽骨吸收[4]。由于所有的牙齿都可以使用，所以可使用最少数量的动物来获得最大量的实验位点。近几年来在猴动物模型上使用生物学材料、釉基质衍生物、引导组织再生技术或种植手术进行牙周组织治疗的研究趋于成熟。通过手术的方法在实验牙的近中形成骨内缺损，模型建立后通过诱导组织再生或釉基质蛋白诱导再生治疗牙周缺损[5]。这一模型与临床治疗极为相似，是一个相关性较好的动物模型。

尽管非人灵长类的牙周病与人类非常类似，但因其花费较高、特殊的饲养要求以及伦理学问题限制了这类动物在牙周病学的研究。

4.2 狗

狗可以发生自发性牙周炎，其自发性或实验性牙周炎的发生机制均与人类相似，其龈下菌斑的构成也与人类很相似，是良好的牙周病研究模型动物[6]。但由于价格相对昂贵，需要特殊的日常照顾，存在饲养问题，限制了狗在牙周病研究的应用。

狗是牙周病治疗研究极佳的模型动物，采用手术的方法可建立各种软硬组织缺损的模型，借助这一模型可以评价多种用于牙周再生的生物学材料或再生性治疗技术的有效性。前磨牙及磨牙区是较常使用的实验位点。除了手术产生牙周缺损外，牙颈部结扎4～6个月或利用大龄狗牙周疾病自发形成的Ⅱ°根分叉病变也可获得牙周缺损[7]。联合技术，牙周结扎联合手术形成牙周缺损，同样可用于评价生物学填充材料和/或再生性治疗技术[8]。狗还被用于建立引导性骨再生和种植手术模型。下颌支及下颌角被用于种植手术，形成临界大小的缺损，填充不同的生物学材料。在植入种植体2个月后出现了种植体周围炎，种植体周围所形成的骨缺损与人的缺损是完全相似的[9]。

4.3 大鼠

大鼠牙龈的结构与人类极为相似，其牙周病的组织病理表现也与人近似，并且大鼠体型小、价格便宜、易于饲养及操控，因此，大鼠是目前应用最多的牙周炎实验动物。大鼠是用于牙周疾病发病机制研究的最为深入的啮齿类动物模型[10]。

天然条件下，大鼠对牙周疾病有很强的抵抗能力，这与人类有着显著的差异。牙颈部结扎、口腔感染人类牙周致病菌、接种微生物或其产物都可诱导牙周疾病的发生。另外，将牙龈注射化学药物或采用手术的方法也成功地建立了牙周疾病动物模型。由于大鼠切牙不断萌出及没有牙根，因而常用的实验牙为磨牙区。

4.3.1 结扎模型

在牙齿周围放置结扎材料来诱导牙周疾病的发生已经被用于多种动物模型，从大鼠到非人灵长类均可。通过在磨牙龈沟内放置结扎材料来增加菌斑聚集、破坏牙龈上皮、增强破骨细胞的作用及骨吸收，可诱导牙周疾病的发生[11]。近来研究者对大鼠的结扎模型产生了高度的兴趣。放置结扎材料可引起牙菌斑及微小溃疡在沟内上皮的聚集，从而有利于牙周致病菌渗透入结缔组织。尽管一些实验表明需要更长的时间，但大鼠最早可在7d时发现牙周附着丧失及牙槽骨吸收[12]。单纯的结扎材料不会引起无菌动物严重的牙龈炎症或牙槽骨的吸收，细菌是导致牙周组织破坏的始动因子，这一结论被系统使用防腐剂及抗生素这一实验所证实，使用防腐剂可以减少牙槽骨的吸收，使用抗生素可以减少牙周附着的丧失及牙槽骨的吸收[13]。使用革兰氏阴性细菌可以增加破骨细胞生成及牙槽骨吸收，这一结果可以进一步证实细菌在这一模型中作用[14]。结扎诱导的模型对某些全身作用很敏感，例如吸烟或慢性精神刺激，与没有暴露在烟草环境中的实验性牙周炎大鼠相比，暴露在烟草环境中的结扎大鼠牙槽骨吸收严重，将结扎的大鼠注射尼古丁结果相似[15，16]。

大鼠结扎模型可用于研究系统疾病对牙周疾病进展的作用，如糖尿病对牙周病的影响[17，18]。结扎诱导牙周炎动物模型中，糖尿病大鼠比血糖正常的大鼠牙槽骨吸收严重。去除结扎材料后，血糖正常组大鼠牙槽骨吸收之后所形成的新骨是糖尿病大鼠的2.4～2.9倍。因此，大鼠结扎模型对研究系统疾病（如糖尿病）对牙周病的影响机制是非常有用的。

4.3.2 接种牙周致病菌模型

通过食物填塞或直接注射可将人类牙周致病菌接种至啮齿类动物口腔。提前使用抗生素来降低内源性的菌群以及重复接种致病菌可以提高感染的重复性。常用的接种剂量是隔天注射连续1周共109CFU，对于一些敏感的菌株可适当增加接种量[19]。早在末次接种后2周或初次感染后3周就能发现牙槽骨的吸收，在末次接种后6周牙槽骨吸收较为明显[20]。牙槽骨的吸收通常发生在上颌磨牙周围，因为下颌的皮质骨较厚且颊舌向直径较宽，所以下颌磨牙周围骨吸收较慢。使用单一牙周致病菌与使用2种及两种以上牙周致病菌所产生的效果是不同的：单一感染Pg的大鼠，感染4周后致病菌在口腔的存留率为45%，而联合感染其他致病菌的大鼠，Pg的存留率为80%～100%。混和感染比单一感染能造成更为严重的牙槽骨吸收[21]。

4.3.3 注射脂多糖模型

革兰氏阴性细菌被认为是重要的牙周致病菌，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是这类细菌细胞壁的组成成分，也是引发内源性免疫反应重要的炎性刺激物。因此，在牙龈组织注射LPS这一模型有利于研究受到这类细菌成分的刺激后内源性免疫反应如何介导炎症反应，刺激破骨细胞的产生及骨吸收。这一模型的组织病理学结果与其他方式建立的牙周炎模型相似。通常将纯化的细菌LPS悬浮于1～6μl的微量体积中，注射于大鼠磨牙的牙龈组织，这一技术的敏感性较高，需要使用微量注射器及较细的针头（28～33G），常用的注射位点是上颌第一磨牙的腭侧，部分研究也将下颌第一、第二磨牙的牙间乳头做为注射点，通常每周3次，最早在注射7d后就能发现牙槽骨丧失，不同来源的LPS对实验结果没有显著影响[22，23]。

4.3.4 化学诱导的大鼠模型

使用化学药物也可诱导口腔组织炎症发生，三硝基苯磺酸（TNBS）或葡萄糖硫酸钠（DSS），这类化学药物通常用于诱导内脏的急性或慢性炎症来评价直肠疾病的炎症进展[24，25]。口腔对DSS或TNBS长达18周的代谢引起口腔黏膜的慢性炎症及牙槽骨的吸收。每2周1次将DSS加入大鼠的饮食中，引起大鼠出现全身系统疾病的表现，加速牙槽骨的吸收。每周2次口服TNBS产生局部的牙周组织反应，上下颌骨出现时间依赖的牙槽骨吸收。将TNBS直接注射到牙龈组织会导致局部严重而快速的炎症细胞渗透、肉芽肿形成以及快速而广泛的牙槽骨吸收。

4.3.5 手术模型

近10年大鼠手术模型被逐渐兴起，通过开窗手术的方法造成下颌第二磨牙牙根表面的牙周组织缺损，标准的缺损为深1.5mm，宽3mm[26]。大鼠也被用于评价釉基质衍生物治疗骨上及骨内的缺损[27]。下颌支、切牙与第一磨牙之间无牙齿的牙槽嵴顶或下颌骨的边缘，都适用于评价引导性骨再生的技术[28]。用手术方法建立的大鼠模型具有广阔的应用前景，但在未来的时间里还需不断的完善。

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