Notch信号在干细胞增殖和分化中作用研究进展＊

李书俊(综述)，王达利(审校)

(遵义医学院附属医院烧伤整形外科，贵州遵义 563099)

干细胞(stem cell)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，可分化为多种功能性成体细胞。其增殖及分化受多种信号通路的调控，如:Wnt/βcatenin、Sonic hedgehog、Notch等;其中 Notch介导的细胞间信号转导在该过程中发挥重要作用［1－2］。Notch基因最早在果蝇体内发现，得名于其功能部分丢失能够导致果蝇翅缘出现一缺口(Notch)［3］，是一组在进化上高度保守的信号转导系统［4］。Notch基因在果蝇等无脊柱动物以及人体内广泛表达，在果蝇体内仅有一个 Notch基因，而人类Notch家族有四个成员(Notch1－4)［3］。Notch蛋白为一种跨膜受体，其激活后通过邻近细胞间相互信号转导作用来调控细胞的增殖与分化［5－6］。现主要围绕Notch信号通路组成及其在成体干细胞增殖和分化中的作用作一综述。

1 Notch信号通路的主要组成

Notch信号通路由受体、配体、CSL(CBF1/RBP－Jκ/Suppressor of Hairless/LAG －1，CSL)及其下游靶基因组成［3］。果蝇中存在一个Notch受体和两个配体(Delta和Serrate)。哺乳动物中有4个Notch同源受体(Notch－1、Notch－2、Notch－3和Notch－4)，分别定为于染色体9 q34、Ip13–p11、19 p13.2 – p13.1 和 6 p21.3;Notch 同源受体均为I型跨膜蛋白，主要由细胞内区、跨膜区和细胞外区三部分结合构成，胞内区包含一个N端RAM结构域、6个锚蛋白样重复序列、2个核定位信号、1个转录激活区及1个PEST结构域。胞内区负责将Notch信号传递到细胞核内。胞外区有29～36个生长因子(epidermal growth factor－like repeats，EGF－R)和3个 LNR(Lin/Notch repeats)重复序列，其中第11、12个EGF－R重复序列介导与配体的相互作用。哺乳动物有6个Notch同源配体，其中与Delta同源的称为Delta配体，分别为Delta－1、Delta－3、Delta－4、Delta－Like;与 Serrate同源的称之 Jagged－1 和 Jagged－2［7－8］。Notch 配体在果蝇中为 Delta和 Serrate，在线虫中为Lag－2。因此，Notch配体又称为DSL(Delta－Serrate－Lag－2)膜蛋白。DSL是Ⅰ型跨膜蛋白，同样具有数量不同的EGF－R重复序列，保守的N端为Notch受体结合和活化所必需的DSL基序［8－9］。CSL是Notch信号通路的重要成员，为CBF1、Su(H)、Lag－1首写字母的缩写，是该蛋白在哺乳动物、果蝇、线虫的不同名称。未活化的CSL通过招募Smar、Skip、1、2型组蛋白去乙酰化酶等蛋白形成共抑制复合物，抑制下游基因的转录，属于转录抑制因子。Notch信号通路的靶基因主要为碱性螺旋－环－螺旋(basic－helix－loop－helix，bHLH)基因［10］。包括HES(members of the hairy and enhancer of split，HES1，2)和 HRT 家族(hairy related transcription factor families of basic－helix－loop－helix transcriptional repressors，Hrt－1，2，3)。如哺乳动物中的Hes基因(hairy enhancer of split)、果蝇中与毛基因同源的 hairy及［E(sp)l］(enhancer of split)及非洲爪蟾中的 Xhey1 等［11］。

2 Notch通路的信号转导

Notch信号通路有两种:CSL依赖通路和CSL非依赖通路。目前的研究主要集中在经典CSL依赖通路，Notch受体被临近细胞表面的配体(Delta和Jagged)激活，经TNFα转化酶(TACE酶)催化，胞外亚基(Notch extracellular domain，NEC)被切割(S1位点)后释放;经γ分泌酶(γ－secretase)催化的跨膜内部切割(S3位点)并释放胞内亚基(Notch intracellular domain，NICD)，继而转入核内与转录因子CSL(在哺乳动物中称为CBF1)的β折叠结构域(RHR －n)结合形成NICD－CSL复合体。该复合体的Rel同源区 (RHR)及其 N端31－435位氨基酸残基与特定的DNA(GTGGGAA)序列结合，进而激活 HES、HRT等靶基因［4］。Notch信号通路不需要第二信使和蛋白激酶的参与，它直接通过接收邻近细胞的信号后传到细胞核，活化相关转录因子，这种信号转导虽然不能放大信号，但使调控细胞分化这种决定细胞命运的重要功能更加精确［12］。Arias等［13］在研究 Notch 基因突变的果蝇发现了CSL非依赖途径，后来在体外实验中进一步证实。随后的研究发现，Deltex蛋白为Notch信号通路下游靶点反馈调节Notch信号通路。对于其他CSL非依赖途径的信号通路尚缺乏证据［14］。

3 Notch信号通路对胚胎干细胞增殖和分化的影响

胚胎干细胞(ESC)属于全能性干细胞，具有自我更新和多向分化能力，可以分化为各种类型的细胞，发育成为各种组织器官。Thomas等［15］研究发现，上调Notch通路能够抑制ESCs向视网膜祖细胞分化，从而促进视网膜祖细胞向视网膜神经细胞分化。Xiao等［16］通过观察小鼠用维甲酸(RA)诱导ESC分化为神经细胞的过程，发现小鼠ESC的Notch l蛋白的表达较高，但随着RA对ESC的诱导分化，神经细胞数量增多，Notch l蛋白的表达逐渐减少。结果表明，Notch 1在维持ESC的分化潜能中发挥作用。Taeko等［17］采用转基因小鼠，发现ESCs对诱导分化表现出不同反应，Notch－Hes1在小鼠ESCs中的表达较波动，Hes1含量较高的ESCs对向中胚层细胞分化敏感，而Hes1含量低的ESCs对向神经元分化较敏感。Hes1含量不同ESCs所产生的结果与Notch信号通路的失活和激活密切相关。

4 Notch通路调控成体干细胞的增殖、分化

目前已从皮肤、肺脏、肌肉、骨髓、脂肪、小肠、脑分离出具有多向分化能力的成体干细胞［18－20］。根据干细胞的分化潜能可分为:全能干细胞、多能干细胞。一般认为只有胚胎干细胞(v)是全能干细胞，具有发育为成熟个体的潜能。成体干细胞的多能性已部分丧失，其发育潜能受组织特异性限制，不能跨系分化。但目前成体干细胞诱导跨系分化的研究结果并不少见，这一看似矛盾的现象可能是由于对成体干细胞的认识不够成熟，也可能是体外培养成体干细胞不能完全模拟体内复杂的微环境所致［2］。Notch信号通过控制细胞命运决定在增殖、分化调控中起着重要作用［21－22］。本文主要讨论Notch信号通路对造血干细胞、神经干细胞、间质干细胞增殖、分化的影响。

4.1 对造血干细胞增殖和分化的影响 研究表明，Notch信号通路在造血系统中发挥多种重要功能。普遍认为Notch对造血干细胞分化命运起决定作用;通过维持造血干细胞的增殖及分化潜能，发挥维持干细胞池的作用，但对成熟后的各种血细胞没有明显维持作用。Notch还是胸腺中的T细胞早期发育的一个关键调节因子［23－24］。Suzuki［16］等向体外培养的脐血造血干细胞培养基中加入可溶性的 Dela－1，辅以干细胞因子(stem cell factor)、血小板生成素等共培养，使造血干细胞存活率增加，并使再增殖细胞(SRCs)数量扩增六倍［25］。Notch信号对增殖和分化的调节又是非常复杂的。Neves等［26］将表达 CD34+、CD38+的造血干细胞与表达Delta－1、Jagged－1的基质细胞共培养，结果提示:Delta－1可增加单向分化祖细胞(CFU－G/CFU－M)的数量，但不影响终末细胞数量;Jagged－1则使CFU－GM和已分化的单核细胞数量减少。当CD34+脐血造血细胞与高表达Delta－4的基质细胞混合培养时，加入促红细胞生成素，可促进CD34+脐血细胞向红系的发育。反之，如阻断Delta－4的表达，这一分化作用即被抑制。由此认为Delta－4有促进人造血干细胞分化的作用［27］。

4.2 对间质干细胞增殖、分化的影响 来源于中胚层的间质细胞广泛分布于各类软组织当中，如脂肪、骨髓、真皮、肝、肺、羊膜等。Huang 等［28］报道，抑制Notch通路的激活，可促进小鼠脂肪干细胞(mASCs)的早期成脂分化，其机制可能与抑制Notch2－Hes1通路，进而提高小鼠脂肪特异转录因子(PPRAR－γ)蛋白的表达，降低DLK－l/Pref－l基因的表达有关。Zuk等［29］采用成脂诱导培养基培养骨髓来源干细胞(ADSCs)，诱导ADSC向成脂细胞分化，结果发现，通过转录抑制剂降低Notch2的表达，可促进ADSCs分化为成脂细胞。Osathanon等［20］采用克隆环技术分离出了人类脂肪组织衍生的单克隆细胞，用流式细胞仪及免疫荧光鉴定其脂肪来源间质干细胞的特征。同时研究Notch信号在这些脂肪来源的单克隆细胞分化中的作用。发现这些单克隆细胞可以分化为成骨细胞和脂肪细胞。然而，每种单克隆细胞的分化潜能是不同的。与高脂肪源性细胞相比，低脂肪源性细胞中 Notch2、3、4，Jagged 1 和Delta 1 mRNA 表达较高。但高成骨细胞和低成骨细胞中未发现Notch信号的mRNA表达改变，而低和高脂肪源性单克隆中Notch受体mRNA表达均减少。此外，采用Notch通路阻断剂(DAPT)可提高脂肪分化。表明Notch信号能抑制单克隆ADSC的成脂分化，并对间质细胞分化命运有重要影响。

Ling等［30］发现小鼠骨间充质干细胞在分化为神经元过程中，MicroRNA－9、神经细胞特异性标志物(GFAP)，微管相关蛋白2(MAP－2)表达增加，Notch 1表达明显减少。说明MicroRNA－9通过下调Notch信号通路促进小鼠骨间充质干细胞分化成神经元。Tao Wang等［31］发现在胚胎14 d的肝组织和胎肝干/祖细胞(FLSPCs)内Notch3高度表达，而在FLSPCs向成熟肝细胞分化的过程中，Notch3及其他干细胞标志物的表达均逐渐降低。当加入Notch通路阻断剂DAPT后，FLSPCs分化为肝细胞/肝样比率明显升高，提示阻断Notch信号通路可促进FLSPCs向肝细胞分化。进一步提示Notch3不仅是FLSPCs分化为肝细胞的调节因子，也是FLSPCs的标志物。牛萍等［32］发现离体实验中犬骨髓间充质干细胞增殖能力较强，离体培养可形成钙结节并且为软骨细胞，并具有心肌细胞标志物的表达，同时在增殖初期可见Notch蛋白的表达，当分化为骨细胞和心肌细胞时，Notch1蛋白的表达下降。

4.3 对神经干细胞增殖、分化的影响 Notch信号通路在神经干细胞增殖、分化过程中也具有重要的作用，是维持干细胞特征及促进神经发生的重要条件［33］。张琦等［34］将神经干细胞离体培养，并诱导分化为神经元及神经胶质细胞后发现:在神经干细胞分化过程中见PS1 mRNA表达均明显下降，PS1的蛋白表达也显著降低，但Notch1、HES1mRNA表达仅在神经干细胞分化初期下降，分化后期各阶段则无明显差异。该结果提示Notch信号通路在维持体外培养的神经干细胞增殖中起着重要的作用。此外，研究发现Notch信号通路的活化可促进星型胶质细胞分化，故Notch的促细胞增殖作用可能同时在神经干细胞与星形胶质细胞增殖中体现［35］。

5 展望

在调控干细胞增殖、分化中，除 Notch信号通路外，同时还存在其他信号通路，根据它们所在的微环境中，通过细胞间相互作用、细胞内信号转导，在维持干细胞特性或促进干细胞多向分化中发挥决定性作用，从而促进或抑制干细胞自我更新，影响和决定各种组织器官或恶性肿瘤的生理和机理状况［36－37］。此外，不同生长因子与 Notch通路共同作用，参与调节干细胞分化［38］。因此，深入研究Notch信号通路有关的调控基因及其效应将更加有助于理解干细胞的增殖、分化及其调控机制。

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