消栓通脉颗粒药物血清对TNF-α 诱导人脐静脉内皮细胞NF-κB表达的影响

阎 伟，白增亮，侯玉芬

1.山东大学生命科学院发育免疫学（济南 250011）

2.山东中医药大学附属医院（济南 250011）

静脉血栓形成（DVT）与炎症有密切关系，它们互相联系，炎症能引起血栓，血栓可加重炎症。核转录因子NF-κB被认为是炎性反应的中心环节，血管内皮细胞激活是这一反应的关键，活化的内皮细胞在NF-κB 系统的调节下，产生一系列黏附分子、细胞因子、酶类等介质，介导或直接参与白细胞和血管内皮细胞的相互作用以及血管的损伤。本研究以TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞为实验模型，从细胞分子角度、蛋白基因水平来探讨NF-κB的表达及中药消栓通脉颗粒的干预作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wistar 雄性大鼠30 只，12 周龄，体质量200～250 g，SPF级，购自山东大学实验动物中心（许可证号：SCXK鲁2003004）。大鼠自由饮水和摄食，饲养室温度23～25 ℃，相对湿度7%左右，定期紫外线室内消毒，适应性饲养1周后开始实验，随机分为消栓通脉颗粒剂分高、中、低剂量三组。

1.2 主要试剂 重组人TNF-α（sigma 公司）；人脐静脉内皮细胞株ECV304（武汉大学典型培养物保藏中心）；NF-κ B p65 siRNA（Cell signaling）；LipofectamineTM2000 复合物（全式金公司）；RNA 反转录试剂盒（Promega）；消栓通脉颗粒，由茵陈、双花、赤小豆、桃仁、黄柏、红花、赤芍、山栀、水蛭、苍术组成，每克相当于3.2 g生药(由山东中医药大学附属医院药剂科提供，鲁药制字Z0120030051)，用蒸馏水制成悬浊液，每mL含1 g消栓通脉颗粒剂。按照人与动物公斤体重比值进行药物剂量的折算。消栓通脉颗粒低剂量为0.6 g/100 g 大鼠，消栓通脉颗粒中剂量为0.9 g/100 g 大鼠，消栓通脉高剂量为1.2 g/100 g，采用灌胃给药，消栓通脉颗粒剂分高、中、低剂量分别灌胃随机分组的大鼠，上下午各一次，间隔12 h，连续3 d，第4 d灌胃后，大鼠股动脉无菌采血，立即置于不加抗凝剂的试管内，离心后分离血清，灭活补体后-20 ℃保存备用。

1.3 模型制备 TNF-α激活人脐静脉血管内皮细胞的培养，购买人脐静脉内皮细胞系，复苏细胞培养，按1∶2 比例接种传代或调整细胞密度到1×106个/mL 分96 孔或24 孔板。用细胞培养基稀释肿瘤坏死因子α（TNF-α）至10 μg/L，孵育细胞。6 h后更换培养基。实验组分别每孔加入100 μL带有高、中、低不同剂量含药血清的培养基，对照组每孔只加入100 μL 培养基，不加药。继续培养24 h 之后，收集细胞用于分析。

1.4 检测指标 RT-PCR 检测目的基因NF-κB 表达量变化：选用Oliger(dT)引物，按Promega 公司Reverse Transcription System 说明书进行，根据内参调整PCR模板量，在一致条件下比较NF-κB表达的变化。PCR引物如下：

GAPDH：

Forward:5’-TGCGACTTCAACAGCAACTGA-3’

Reverse:5’-GTCCAGGGTTTCTTACTCCTT-3’

NF-κB：

Forward：5’-CCCACAGAGCTTGTAGGAAAG-3’

Reverse：5’-TAGTCCCCACGCTGCTCTTCT-3’

Western-blotting 方法检测目的蛋白NF-κB 表达量的变化，α-Tublin 内参对照，一抗NF-κB p65和单抗免IgG-HRP 二抗为美国santa cruz 公司产品。二抗goat anti-rabbit IgG-HRP（santa cruz biotechnology, 美国）。

1.5 结果分析 Quantity One 软件分析RT-PCR 和蛋白免疫印记结果，NF-κBmRNA 及蛋白表达量以NF-κB 与内参条带光密度值的比值表示。采用SPSS11.0 统计软件包进行数据分析，两组间差异比较用t检验，多组间差异比较用方差分析，P ＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TNF-α激活人脐静脉内皮细胞中NF-κB的表达（图1） RT-PCR 结果显示，TNF-α 激活人脐静脉内皮细胞中NF-κB 的表达与对照组相比有显著性差异（P ＜0.01），人脐静脉内皮细胞经TNF-α刺激后，NF-κB mRNA的表达水平比未激活的细胞中明显升高。

图1 TNF-α激活人脐静脉内皮细胞NF-κB表达

2.2 消栓通脉颗粒剂使激活后的人脐静脉细胞中NF-κB表达水平减低（图2、图3） RT-PCR和蛋白免疫印记结果显示，经消栓通脉颗粒剂干预后，激活的人脐静脉内皮细胞中的NF-κB表达水平下降，且该抑制作用呈剂量依赖效应，高剂量含药血清作用下，NF-κB 表达水平与对照组相比显著降低（P ＜0.01）。

图2 不同消栓通脉颗粒剂量刺激下NF-κB mRNA表达

图3 不同消栓通脉颗粒剂量刺激下NF-κB 蛋白表达

3 讨论

深静脉血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）是一种常见的四肢血管血栓栓塞性疾病，流行病学研究发现，亚洲骨科大手术后发生率为31%，我国人工关节成形术后发生率为47.1%[1]。 急性期易并发肺栓塞(pulmonary embolism，PE)，死亡率较高。慢性期因静脉瓣膜遭受破坏，至晚期患肢出现肿胀、郁积性皮炎、顽固性溃疡等后遗症，严重影响病人的生命质量。发现炎症与血栓形成之间存在着显著而错综复杂的联系，在DVT 病理过程中，NF-κB 被认为是炎性反应的中心环节。NF-κB 是血管炎性过程中的中心转录控制点，以NF-κB转录因子家族为调控中心的内皮细胞活化及炎症基因诱导途径有可能成为有关危险因子促血栓形成的共同途径[2-3]。TNF-α是一种主要由活化的单核巨噬细胞系统分泌的炎症介质[4]。对血管内皮细胞有多方面的作用，其损伤作用表现为对血管内皮细胞的直接作用或通过其他细胞因子产生的作用，造成血管内皮细胞损害[5]。

消栓通脉颗粒由茵陈、金银花、赤小豆、桃仁、黄柏、红花、赤芍药、栀子、水蛭、苍术组成，诸药合用，共奏清热利湿，祛瘀通络，消肿止痛之功效。现代药理学研究证实：茵陈还有抗凝血及促纤溶的功效。赤芍药具有抗血小板聚集、改善血液流变学、抑制凝血酶原等多种作用。桃仁有抗急性炎症渗出的作用，对体外血栓形成具有明显的抑制作用。水蛭富含蛋白质、水蛭素、肝素等物质，具有抗凝、抗血栓等作用。实验表明，金银花对早期血管通透性增高和渗出性水肿具有明显抑制作用，而黄柏中的小檗碱成分具有抗血小板聚集的作用。红花黄色素作为红花的主要作用成分具有抑制血小板聚集和释放，抗凝血，抑制血栓形成，抗氧化、抗氧自由基等作用。

通过研究以TNF-α 诱导人脐静脉内皮细胞建立血管内皮细胞损伤模型，用含中药消栓通脉颗粒血清进行干预，实验证明：TNF-α 诱导人脐静脉内皮细胞可使NF-κB表达显著增加，消栓通脉颗粒含药血清可以抑制NF-κB 的表达。NF-κB 是调节细胞基因转录的关键因子之一，而这些因子又对相应细胞的活化、增殖、浸润、趋化和分泌功能起着直接的调控作用，是调节免疫反应、应激反应、凋亡和炎症的中心环节，也是诸多炎性介质产生的共同通路。NF-κB不仅参与了炎症发生的过程，而且在血栓形成中可能还扮演着十分重要的角色。NF-κB作为炎症与血栓过程中多种细胞活性分子的汇聚点，有可能成为防治DVT的新的理想靶点。实验证实：消栓通脉颗粒明显抑制TNF-α激活的血管内皮细胞中NF-κB 的表达，阻止炎症—血栓反应，从而防治血栓形成。

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