幽门螺杆菌免疫学检测方法研究进展

常艳萍，吴利先

（大理学院基础医学院微生物学及免疫学教研室，云南 大理671000）

幽门螺杆菌（helicobacter pylori，Hp）是1982年由澳大亚学者Warren和Marshall从胃炎和消化性溃疡病人胃黏膜活体组织中培养出来的一种革兰氏阴性螺旋形细长微弯杆菌。Hp感染不仅能引起慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃癌和胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等多种胃肠道疾病，并且HP被证实为I类致胃癌致病因子［1，2］。此菌在世界不同地区、不同种族感染率有所差异，尤其在发展中国家其感染率较高，而我国自然人群感染率约54．76%，而现症感染率平均高达55%［3］。因此建立快速、准确、安全的检测方法对Hp感染的诊断和治疗极为重要。而近些年随着HP单克隆抗体制备技术和蛋白组学的研究深入，Hp酶联免疫吸附技术，胶体金免疫技术，免疫印迹技术以及蛋白芯片等免疫诊断方法效能逐步提高，其用于现症感染和临床疗效观察中取得了可喜的进展，本文就此综述如下。

1 酶免疫分析诊断法

1．1 酶联免疫吸附试验

酶联免 疫 吸 附 试 验 （enzyme linked immunosorbent as－say，ELISA）是用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗用最广的技术。ELISA可以采集病人的血液、唾液、尿液及粪便等标本检测抗体。

张林等［4］以重组 Hp热休克蛋白A亚单位（rHspA）和尿素酶B亚单位（rUreB）的混合物为抗原，制备成 HPELISA诊断试剂检测126例患者的尿液和血清，显示HPELISA诊断试剂的特异性和敏感性明显优于以Hp超声离心上清液为抗原的同类试剂，此试剂检测血清IgA、尿液IgG、血清IgG的效能依次升高。与血清学相比，尿液IgG检测具有更高的敏感性，但服用影响尿液PH值的药物会影响其检测结果。ELISA法检测尿液中的IgG抗体，其Se为95．45%，Sp为81．25%，π为92．68%［5］。白艳艳等［6］以 Hp重组纯化蛋白ureB为抗原免疫动物制备Hp－ureB单克隆抗体，用间接ELISA法检测抗体免疫活性，表明Hp－ureB单抗可特异性与Hp结合，可作为一种新的单克隆抗体试剂盒检测患者血清中特异性抗体，具有较高的特异性和灵敏性。血清学方法可以用于对治疗疗效的观察，尿液检测可用于Hp感染诊断，特别适用于流行病学调查和治疗疗效观察。

近年来 HP－ELISA方法检测粪便的报道较多，用ELISA检测粪便中的多克隆抗体，其现症感染的检测效果与呼气试验等同。ELISA方法用于儿童粪便检测，HpSA检测的敏感性和特异性分别为93．3%和98．7%［7］。但是，此法会出现假阳性结果且结肠内长时间滞留Hp，在根除治疗后也会出现假阳性结果［8］。HP－ELISA方法检测粪便使用方便、廉价、省时，可替代血清学方法用于流行病学调查。但只有在没有经过长时间的运输或者足以影响到结果的不适当的储存时，用HP－ELISA方法检测粪便HpSA才能有比较高的精度。

ELISA方法对尿液中的IgG抗体检测不能区分是现状感染还是曾经感染过，但它仍具有很多优点：（1）尿液容易收集，而且其收藏要求很少的技术，（2）尿液标本不需要离心，（3）是一种完全的非侵入性方法且容易操作，（4）尿液测试可以用于医院的检测或者家庭测试，（5）尿液中的Hp特异性IgG抗体，在4℃中冷藏可以至少保存60天，（6）低水平的Hp抗体也可以在尿液中检测到［9］。从幽门螺杆菌感染者的尿液中检测抗体，不仅能快速可靠的诊断Hp感染，而且价格低廉，容易操作，适合对未感染人群的检测。

ELISA法的主要依赖的是天然抗原，抗原必须能产生高度的免疫性，易准备和纯化，而且必须能稳定存储。ELISA法由于操作复杂，时间较长，给临床诊断和研究带来不便，因此出现一些快速检测试剂盒。目前已研发出多种商品性的ELISA检测试剂盒，但公认以酶联免疫吸附试验和免疫印迹试验为优，具有较高的特异性，并能进行定量分析，主要适用于流行病学调查。

1．2 酶免疫测定

酶免疫测定（enzyme immunoassay，EIA）法是一种新型检测Hp的非侵入性实验。其原理是将抗人Hp特异性多克隆抗体包被在反应板的反应孔中，标本中抗原与抗人Hp特异性多克隆抗体－辣根过氧化物酶结合物反应，根据显色判断结果。鄢盛恺等［10］首次在国内应用酶免疫测定法检测幽门螺杆菌粪便抗原（Hp stool antigen），其敏感性、特异性和准确性分别为：94．7%、95．7%和95．1%。酶免疫测定法检测HpSA具有敏感性高、特异性强，操作简便的特点，适合普通实验室作为常规项目开展。此法既可以用于幽门螺杆菌感染的筛选与诊断，也合适根除治疗的检测。

2 胶体金免疫试验

免疫胶体金技术（immune colloidal gold technique）是继同位素、荧光素和酶三大标记技术之后，又一较为成熟且得到广泛应用的免疫标记技术。1971年Faulk和Taytor［11］将胶体金应用于免疫化学后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了广泛应用。目前用于Hp检测主要有免疫层析（immunochromatogra－phy）、快速免疫金渗滤法（Dot－immuogold filtration assay，DIGFA），HP快速免疫测试卡和金标试条法等，具有简便、准确、快速和无污染等优点。

2．1 胶体金免疫层析实验

Cherian，Sarah等［12］193例儿童患者做免疫层析实验，结果显示灵敏性为74．6%，特异性为63．6%。SILVA等［13］报道，用免疫层析法检测患者HpSA，其敏感性和特异性分别为88%和87．5%。免疫层析法检测患者粪便中抗原可以获得和13C呼气实验一样的诊断效果。

据报道［14］将HP用胶体金的基因工程HP尿素酶抗原结合膜免疫层析原理，应用双抗原夹心制成的胶体金标记的HP抗原印迹膜，对86例胃、十二指肠患者采集血清标本进行检测。检测结果显示：慢性胃炎，消化性溃疡和胃癌中的空泡细胞毒素（VacA）总阳性率分别为56．1%，88．49%和100%。可见VacA总阳性率随着病变严重程度逐渐升高。胶体金法检测血清Hp抗体可对Hp感染情况进行分型。操作简便且特异性强、敏感度高，结合其他诊断方法可以准确对消化道溃疡及胃癌进行临床诊断及判断疾病的预后。贾克东等［15］分别以金免疫抗原检测、尿素酶实验、血清学抗体检测3种方法对60例患者进行检测对比。结果显示金免疫抗原检测胃液、粪便和血清标本中的准确率分别为：69．04%，57．14%和40．48%。胶体金免疫法测定Hp抗原诊断Hp感染的敏感性和特异性有待进一步提高，但其属于非侵入性检查，而且具有简便、快速、准确等的优点，尤其以胃液和粪便检测效果更好，具有很大的发展前景。

2．2 快速免疫金渗滤法

快速免疫金渗滤法（DIGFA）的原理与斑点免疫金染色法相同，只是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗原），再加金标记第二抗体，在数分钟内即可显出颜色反应。

有学者报道［16］采用DIGFA检测患者末梢血及唾液中的抗Hp－IgG抗体。末梢血抗Hp－IgG法诊断Hp检测阳性率84%，诊断Hp现症感染的准确性分别为72．72%，敏感性为94．64%，特异性分别为35．29%，唾液抗 Hp－IgG法诊断Hp检测阳性率58%，诊断Hp现症感染的准确性分别为90%，敏感性为85．71%，特异性为97．06%。DIGFA法检测唾液中抗Hp－IgG具有准确性高、敏感性强、特异性高的优点，且为非侵入性、简便、快速、价廉的方法，适合于临床推广。血抗Hp－IgG检测适合于流行病学调查。

2．3 HP快速免疫测试卡

Hp感染引起的消化道溃疡治愈后，常会出现溃疡复发，复发的溃疡病人均有Hp再感染。可见体内可能有其它适宜Hp生存的环境。口腔牙周袋内有适合兼性厌氧菌生长的环境，且菌斑内细菌发酵产酸可以降低pH值，有利于Hp的生长［17］。因此口腔Hp的检测对HP的感染诊断和治疗有重要意义。

李前等［18］采用幽门螺杆菌快速检定卡对56例有消化道症状的患儿做牙垢幽门螺杆菌抗原检测，结果表明：牙垢幽门螺杆菌抗原检测HP感染的敏感度和准确性分别为97．9%和91．1%。牙垢幽门螺旋杆菌抗原检测法是一种非侵人性的Hp检测法，具有取材方便、操作简单、快捷，多次重复获取牙垢标本，患儿无痛苦，又经济，是儿童HP感染的诊断及治疗后复查最好的方法。成虹等［19］采集患者的粪便标本作HpSA快速免疫卡检测，与“金标准”相比，其敏感度和特异度分别为：100%、93．2%，因此，HpSA快速免疫检测卡检测粪便Hp抗原可以用于临床Hp现症感染的诊断和Hp根除治疗的结果判断。

3 免疫印迹技术

免疫印迹技术（immunoblotting）：免疫印迹是一种较新的免疫化学技术。用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）将Hp中分子量大小不同的蛋白组份分离，得到的不同区带与待检血清中相应抗体相结合，通过显色来判断患者Hp感染情况。

免疫印迹检测Hp特异性标记物已多种商品化试剂盒。单克隆抗体夹心ELISA试剂盒，其敏感性为98%－100%，特异性为76%，可以用于根除治疗早期诊断［20］。陆海英等［21］应用免疫印迹技术对慢性上消化道患者进行HP血清学分型检测，结果显示I型检出率为65．08%，Ⅱ型检出率为28．11%，总检出率93．20%。但某些检测出Hp I型抗体阳性的患者，其胃镜和呼气试验并不支持患者现在患有慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌等胃肠道疾病［22］。有学者报道［23］，用Hp免疫印迹检测分类抗体试剂盒检测胃炎患者血清中CagA和VacA，结果显示，其敏感性为98．4%，特异性为96%，且可以同时检测出Hp多种抗体。与14C－UBT组合检测对Hp诊断和治疗有重要意义，尤其可以用于Hp感染分型的检测。此检测方法具有较高的特异性和灵敏度，简便，快速，无创等优点，较适合临床广泛推广应用。

4 蛋白芯片技术

HP抗体蛋白芯片检测系统利用基因重组技术包被HP的抗原，经微孔滤膜的渗滤、浓缩、凝集作用，使抗原抗体在固相膜上快速反应。目前蛋白芯片包被的HP抗原主要有CagA、VacA、Ure、Hsp60及RdxA等5种蛋白，可同时检测5种抗体。蛋白芯片检测UreB，CagA和VacA抗体的敏感性分别为93．4%、95．4%和96．0%，特异性为94．8%、94．4%和97．5%。蛋白芯片技术是一个非常实用的能快速检测多重抗体血清样品的方法，它特别适用HP流行病学调查［24］。

5 其他

张爱军等［25］用金标法检测胃肠道疾病Hp感染病人的血清，其敏感性，特异性和诊断效率分别为88．6%，86．8%和87．1%，和RUT相比无明显差异。但血清学检测具有无创，方便，重复性好等优点，适用于儿童，孕妇等体弱者。由于血清中抗体的持续存在和产生时间，使其检测存在假阳性和假阴性，因此不适合对Hp根除治疗的判断，可用作Hp感染的初筛。胶乳凝集试验是以乳胶颗粒作为载体的一种间接凝集试验。用结合在胶乳颗粒或胶体金上的Hp抗原检测微量血中特异性的抗体，根据出现肉眼可见的凝集反应进行判断。现已有商品化试剂盒面市，具有不需特殊仪器，样本需要量少等优点，但准确性稍低。补体结合试验、被动血凝反应、细菌凝集反应等均可用于Hp菌体抗体的检测。但是敏感性、特异性、可靠性较低，现在很少应用。

6 展望

目前，Hp是危害人类健康的最主要的病原体之一，尤其在发展中国家的感染率高达80%。Hp感染不仅引发胃肠道疾病，近年研究显示还与心血管、口腔疾病、糖尿病、血液病等多种胃肠道外疾病密切相关［26，27］。因此对Hp检测对其调查现症感染和疗效观察以及预后判断诊断尤为重要，而随着单克隆抗体技术、免疫标记技术以及蛋白芯片等新技术的应用，相信在不久将来，研制出更多高灵敏度和特异度以及经济简易的Hp诊断试剂盒，对Hp病原体初诊和根治检查具有重要影响意义。

［1］ZULLO A，Hassan C，Trapani S，et al．Rapid urease test for H．pylori diangnosis：pros and cons［J］．Intern Emerg Med，2010（5）：257．

［2］Cho SJ，Choi IJ，Kim CG，et al．Helicobacter pylori seropositivity is associated with gastric cancer regardless of tumor subtype in Korea［J］．Gut Liver，2010，4：466．

［3］张万岱，胡伏莲，萧树东，等．中国自然人群幽门螺杆菌感染的流行病学调查［J］．现代消化及介入诊疗，2010，15（5）：265．

［4］张 林，安黎云，王缚鲲，等．应用纯化抗原检测尿液和血清抗幽门螺杆菌抗体的比较［J］．实用医技杂志，2004，11（9）：1702．

［5］Md．Islam，Sufi Rahman，SM Shamsuzzaman，et al．Urine－Based ELISA for the Detection of Helicobacter pylori IgG Antibody and Comparison with Other Invasive Methods［J］．Bangladesh J Med Microbiol，2010，4（1）：14．

［6］白艳艳，王兆钺，白 霞，等．幽门螺杆菌尿素酶B单克隆抗体的制备、鉴定及应用［J］．中国病理生理杂志，2006，22（3）：622．

［7］Elena D，Anna R，Renzo B，et al．High Accuracy Of Noninvasive Tests To Diagnose Helicobacter Pylori Infection In Very Young Children［J］．The Journal of Pediatrics，2006，149（6）：817．

［8］Pum SK，Jongwook L，Soo HP．Detection of Helicobacter pylori antigen in stool by enzyme immunoassay［J］．Y0nsei Medical Journal，2002，43（1）：7．

［9］Fu－Chen Kuo，Sheng－Wen Wang，I－Chen Wu，et al．Evaluation of urine ELISA test for detecting Helicobacter pylori infection in Taiwan：A prospective study［J］．World J Gastroenterol，2005，11（35）：5545．

［10］鄢盛恺，林其燧，宋耀虹，等．酶免疫法检测粪便幽门螺杆菌抗原［J］．中华检验医学杂志，2000，23（3）：150．

［11］Faulk WP，Taylar GM．An immunocolloid method for the electron microscope［J］．Immunochemistey，1971，8（11）：1081．

［12］Cherian SB，David P，Carson CF，et al．Diagnosis of Helicobacter pylori Infection in a High－prevalence Pediatric Population：AComparison of 2Fecal Antigen Testing Methods and Serology［J］．Journal of Pediatric Gastroenterology ＆ Nutrition，2008，47（2）：130．

［13］Silva JMK，Villares CA，Monteiro MS．Validation of a rapid stool antigen test for diagnosis of Helicobacter pylori infection［J］．Rev Inst Med Trop Sao Paulo，2010，52（3）：125．

［14］温洪周．胶体金技术诊断幽门螺杆菌感染分析［J］．现代医药卫生，2011，27（3）：331．

［15］贾克东，丁元军，刘东林，等．标记人血清抗体IgG胶体金免疫法对不同标本幽门螺杆菌抗原的测定［J］．中华实验和临床感染病杂志，2009，3（1）：1．

［16］陈玉丽，陈奕贵，吴 婷，等．几种幽门螺杆菌检测方法比较［J］．中国人兽共患病杂志，2001，17（1）：56．

［17］陈光华，张佰成，潘广霞．口腔幽门螺杆菌的探讨［J］．中国实验诊断学，2011，15（12）：2192．

［18］李 前，杨佩然，陈笑瑜，等．儿童牙垢幽门螺杆菌抗原检测的临床研究［J］．中国临床实用医学，2010，4（10）：101．

［19］成 虹，胡伏莲．幽门螺杆菌粪便抗原免疫卡在诊断幽门螺杆菌现症感染和判断其在根除治疗中的价值［J］．中华医学杂志，2004，14：1166．

［20］Calvet X，Quesada M．Diagnosis of Helicobacter pylori infection in dyspeptic patients by stool antigen detection：usefulness of a new monoclonal enzyme immunoassay test［J］．Digestive and Liver Disease，2004，36（7）：450．

［21］陈海英，番 敏，张 柳．免疫印迹技术在临床幽门螺杆菌检测中的应用［J］．中国实验诊断学，2006，10（9）：995．

［22］张韶斌，陈斯亮，罗莞趣，等．免疫印迹技术对幽门螺杆菌感染的分型诊断及其临床意义［J］．实用医技杂志，2007，14（32）：4393．

［23］虞晓红．胃炎患者血清幽门螺杆菌分类抗免疫印迹检测的临床意义［J］．现代医药卫生，2005，21（23）：3214．

［24］Han FC，Li XJ，Jiang H，et al．Detection of H．pylori antibody profile in serum by protein array［J］．World J Gastroenterol，2006，12（25）：4044．

［25］张爱军，张晓艳．几种常用幽门螺杆菌检测方法的合理应用［J］．中国现代药物应用，2009，3（4）：111．

［26］Arnold DM，Bernotas A，Nazi I，et al．Platelet count response to H．pylori treatment in patients with immune thrombocytopenic purpura with and without H．pylori infection：a systematic review ［J］．Haematologica，2009，94：850．

［27］Yuan W，Li Y，Yang K，et al．Iron deficiency anemia in Helicobacter pylori infection：meta－analysis of randomized controlled trials［J］．Scand J Gastroenterol，2010，45：665．