Wnt信号通路与血管再狭窄关系研究进展及药物干预前景

华军益 何煜舟

Wnt信号通路与血管再狭窄关系研究进展及药物干预前景

华军益 何煜舟

冠脉支架术后再狭窄（restenosis，RS）一直是限制其远期疗效的最大难题，药物涂层支架的问世将RS率降至10%左右[1]，但并没有从根本意义上消除RS。深入研究血管损伤后RS的基因调控机制可能是最终解决这个难题的关键。

经皮冠状动脉成形术（percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）后RS的发生机制目前尚不十分清楚，如何预防RS仍然是当前心血管病学研究领域所面临的主要课题之一。目前认为RS形成过程为：球囊扩张对血管壁的直接损伤、血管壁的弹性回缩及血小板的黏附、聚集等始动因素，激发了血管壁炎症反应，导致多种炎症因子、细胞生长因子的释放，促进原癌基因的异常表达和调节细胞周期的蛋白质合成，其结果促进血栓形成、细胞增殖和基质堆积导致RS。大多数学者认为中膜平滑肌细胞（smooth muscle cell,SMC）增生、迁移并分泌大量细胞外基质形成增厚的新生内膜是造成RS的直接原因[1-3]。在这个过程中，SMC通过自分泌、内皮和外膜及血液成分通过旁分泌等形式共同参与了SMC的增殖、迁移和转型。实验研究中，利用抑制SMC增殖的某些药物可减轻血管成形术后RS的程度。需要指出的是：血管平滑肌细胞（vascular SMC,VSMC）和成纤维细胞的增殖和分泌细胞外基质(extracellularmatrix, ECM)是造成血管内膜增厚的最重要原因，另外还包括了内皮细胞、血小板和血细胞，成纤维细胞等多种细胞复杂的共同作用促成了血管RS。

Wnt是一组分泌型糖蛋白家族，哺乳动物有19个Wnt蛋白、10个Fzd受体、2个Lrp辅助受体。Wnt信号通路是一条在生物进化过程中极为保守的通路，在正常生长发育中起关键作用。Wnt作用机制有两种：经典通路和非经典通路。近年有研究[4]认为每个Wnt蛋白既可激活经典通路也可激活非经典通路，取决于细胞表面的Wnt-Fzd结合物的特异性。经典Wnt通路即Wnt/βcatenin信号通路，常见且研究较为透彻。在没有Wnt信号刺激的情况下，结直肠腺瘤性息肉（adenomatous polyposis coli,APC）基因产物、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）、轴蛋白和转导蛋白（anxin or conductin）构成降解复合体将β连环蛋白磷酸化，进而与泛素蛋白（ubiquition,Ub）结合被泛素化降解，胞质内β-catenin维持低水平从而维持细胞的稳态。当细胞分泌的Wnt蛋白与细胞跨膜受体特异受体卷曲蛋白（frizzle,Frz）及辅助受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（LRP5/6）结合后，活化细胞内DVL-1蛋白，抑制胞质内β-catenin与Axin-APC-GSK-3β等形成降解复合物，导致β-catenin在细胞质内积累并转移至核内，与核内转录因子T细胞因子（TCF）/淋巴样增强因子（LEF）相结合，启动靶基因c-myc、cyclin D1等转录，从而调控细胞生长。已经有很多研究表明Wnt信号通路参与了某些实体肿瘤和血液系统肿瘤的发生、发展。近年来有研究提示Wnt信号通路参与调节VSMC的发育以及损伤后的增殖；也有研究[5]发现大鼠颈动脉受损后Wnt通路的某些信号分子高表达，这些提示Wnt信号通路可能在球囊损伤后血管RS中起作用，尤其可能参与调控了中膜SMC增殖、迁移和内膜新生过程；Wnt信号通路有可能成为抗血管RS新治疗的靶点。

1 Wnt信号通路和血管内皮在RS中的作用

内皮细胞是一层连续覆盖于整个血管腔表面的扁平细胞，是血管基底膜的重要组成部分，是血液与血管壁和组织之间的物理屏障，能够合成和分泌NO、PDGF、ET-1、FGF等多种活性因子。内皮损伤是引起RS的始动因素，内皮细胞受损后NO和PGI的分泌减少，炎症细胞浸润，抗血小板聚集和抗增殖作用减弱，VSMC在内皮缺失的部位移行和过度增殖[6]。球囊损伤后内皮功能障碍与血管重塑关系密切。

在内皮细胞培养中，Wnt1和Wnt3a可以刺激内皮细胞的增殖，同时诱导了下游β-catenin/LEF/TCF的表达增多[7-8]。在体实验也观察到心肌梗死后梗死区的血管发生中，β-catenin的定位从内皮细胞的胞膜转移到胞质中同时伴DVL-1表达增加[9]，表明Wnt-frizzled信号通路参与了血管内皮细胞的增殖调控。在血管损伤后愈合过程中，内皮细胞的Wnt信号通路被激活，一方面可能通过自分泌方式促进损伤血管内皮化，对创伤起到积极的修复作用。另一方面，也可能通过旁分泌方式（分泌Wnt蛋白）作用于中膜SMC，影响其增殖、移行。

2 Wnt信号通路和VSMC在血管重构中作用

血管中膜SMC增殖、迁移并分泌大量细胞外基质是动脉粥样硬化和损伤后RS形成的核心病理过程，最终使新生内膜形成、血管壁增厚。相对于主动脉来说，冠状动脉和颈动脉属于中动脉，中动脉的中膜主要由SMC组成，推测这可能是PTCA术后冠状动脉和颈动脉容易发生RS的解剖特点。深入研究VSMC增殖、移行的调控机制是最终解决RS难题的必经之路。

在血管RS过程中，SMC通过自分泌、内皮和外膜及血液成分通过旁分泌等形式共同参与了SMC的增生迁移和转型。因此，RS过程是多种细胞和血液成分通过众多细胞因子、炎症因子以及信号通路间复杂的交互网络共同作用而形成。

PTCA术后血管内膜被撕脱，内皮下基质和胶原暴露，内皮细胞产生ET-1、VEGF、黏附因子和血管紧张素转化酶等多种血管活性分子，中膜SMC在多种生长因子和血管活性物质的刺激下被激活并不断增殖[6]，局部激活因子表达增强并活化金属基质蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMPs），降解成份复杂结构致密的ECM，使中膜SMC得以迁移到内膜层[6,10]。已有文献报道[11]，血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）可以通过TGF-β/ Smad信号途径促进SMC的增殖和胶原合成。在粥样硬化斑块和血管RS的部位，TGF-β和Smad基因表达及活性明显增高并延续至ECM形成的全过程[12-13]。

笔者在离体和在体两个水平证实了Wnt信号通路参与调控了VSMC增殖和胶原合成。用AngⅡ刺激VSMC增殖，检测到Wnt4/DVL-1/β-catenin高表达，以SiRNA技术阻断Wnt通路可以抑制AngⅡ对VSMC的促增殖作用。与Tsaousi等[14]最新研究结果相一致；同时在球囊损伤的大鼠颈动脉检测到Wnt4/DVL-1/βcatenin信号分子表达增加，而Wang等[5]研究显示大鼠颈动脉受损伤后β-catenin/TCF信号激活，两个结果结合起来，说明Wnt经典通路参与血管RS病理过程调控。Chen等[15]研究指出DVL-1可能对心肌梗死后成纤维细胞和血管内皮细胞增殖、移行有影响，对心肌梗死损伤后修复起重要作用。笔者在离体细胞和在体动物实验中也发现增殖状态下的VSMC和血管损伤后重构的内中外膜均存在dvl-1 mRNA和蛋白水平高表达，推测DVL-1可能对血管损伤后重构过程中包括SMC、成纤维细胞在内的多种细胞激活、增殖和分泌ECM都有作用。

3 Wnt信号通路在血管重构中ECM形成和降解中的作用

AngⅡ可以通过TGF-β/Smad信号途径促进SMC的增殖和胶原合成[12-13]。Rodrigues等[16]认为AngⅡ可以不依赖TGF-β直接激活VSMC的Smad通路，促进血管内膜胶原合成。笔者的研究发现AngⅡ可以通过Wnt经典信号途径促进SMC的增殖和胶原合成，Wnt信号通路和TGF-β/Smad信号途径有何交互联系,AngⅡ可以直接激活以上两个信号通路还是先激活其中一个信号途径，进一步通过信号途径间的交互联系使另外一个途径激活，值得进一步研究。

Wu等[17]离体研究发现Wnt/β-catenin/TCF/LEF通路可以直接作用MMPs的启动子，使MMP表达增加降解ECM，便于T细胞通过基底膜移行，首次揭示了Wnt通路对MMP家族有直接作用。这个结果使笔者联想到在血管损伤RS过程中Wnt信号激活，使MMPs表达增加，可能有助于中膜VSMC通过被降解的ECM移行至内膜。笔者的实验表明，Wnt信号通路的激活在AngⅡ刺激VSMC合成胶原过程中起作用。这与Wu的研究看似矛盾，其实不然，Wnt经典通路的激活一方面促进中膜SMC周围的ECM降解利于其移行，另一方面促进已经移行至内膜的SMC增殖和合成胶原。这是否意味着Wnt经典通路对血管重构过程中ECM的降解、合成具有双向调控作用？如果这种双向调控作用确实存在，就可以解释为什么动脉RS仅仅是内膜增厚而中膜变化不明显，即Wnt信号在中膜主要与ECM降解和SMC移行有关，当VSMC移行至内膜后，Wnt信号主要参与了其大量增殖和分泌ECM，ECM在内膜的合成远大于降解导致内膜增厚。

Wnt信号通路可以调控成纤维细胞增殖以及心脏重构过程中内皮间充质转化[18-19]，Chen等[15]研究指出DVL-1可能对心肌梗死后成纤维细胞增殖、移行有影响，对梗死后心脏重构起重要作用。笔者在离体细胞和动物在体实验中也发现增殖状态下的VSMC和血管损伤后重构的内中外膜均存在dvl-1 mRNA和蛋白水平高表达，推测DVL-1可能对血管损伤后重构过程中成纤维细胞增殖、分泌ECM有作用。血管外膜以大量成纤维细胞为主，当血管受损伤时，成纤维细胞具有修复外膜的能力。目前认为外膜成纤维细胞涉及血管损伤后RS过程，事实上对血管损伤反应活跃的这种非肌性细胞仅少量存在于中膜，绝大部分分布在外膜，且具有增殖、迁移、黏附、表达n-SM actin及合成细胞外基质蛋白的能力。也就是说，在某些刺激因子作用下，成纤维细胞的表型可以转变为肌成纤维细胞，表达α-肌动蛋白，并从外膜迁移至内膜。当血管外膜受损，即便血管内皮正常，同样会出现动脉粥样硬化病变，均提示血管壁外膜参与了血管RS过程[20]。深入研究Wnt信号通路对外膜成纤维细胞的调控作用对揭示血管RS机制和寻求有效干预措施非常重要。

4 药物预防血管RS

血管重构一旦形成，目前还没有使其逆转的有效方法，所以血管RS仍是以预防为主。目前研究已发现某些西药和中药对预防RS可能有效。

4.1 他汀类 目前认为是最有效的预防PCI术后血管RS的药物之一。他汀预防血管RS与其调脂外作用关系密切。包括抗炎、抗氧化应激、抗增殖、保护内皮、抑制泡沫细胞形成等。但其预防血管RS的分子机制尚未完全研究透彻。阿托伐他汀可以通过抑制AngⅡ诱导的人肠系膜动脉VSMC NADPH氧化酶-活性氧通路，从而抑制SMC的增殖[21]。Chan等[22]研究指出辛伐他汀可以通过抑制细胞周期依赖的激酶抑制剂（CDKI）和p53途径，抑制对葡萄糖刺激的主动脉SMC的增殖。也有研究指出，阿托伐他汀抑制高血压诱导的血管重构与其抗氧化特性直接相关[23]。笔者在实验中发现阿托伐他汀可以通过下调Wnt经典通路抑制VSMC的增殖和ECM合成，但很可能不是唯一途径。

4.2 细胞有丝分裂抑制剂 如雷帕霉素、紫杉醇等，已经被广泛应用于药物洗脱支架并大大降低了PCI术后RS率。这类药物可以在支架局部抑制SMC增殖从而减轻内膜反应性增厚，但这类药物同样也抑制了血管损伤处内皮的生长导致支架内皮化延迟，有增加支架内血栓形成的风险。

4.3 中药 中药预防PTCA术后RS的研究虽起步较晚，但实验研究表明其可作用于RS的多个病理环节，临床观察亦证明有一定效果，值得深入研究和开发。许多具有活血化瘀功效的中药如川芎嗪、丹参、三七总皂甙等被证实有抑制VSMC增殖的作用[24-25]。川芎嗪可以下调RS部位VSMC的成纤维细胞生长因子mRNA、原癌基因c-myc mRNA表达，上调抑癌基因p53 mRNA、内皮衍化舒张因子mRNA表达，说明川芎嗪抑制内膜增殖可能与调节VSMC增殖相关基因表达有关系[26]。也有研究显示川芎嗪、葛根素等可以抑制VSMC合成胶原[27-28]。某些具有抗炎作用的中药，如大黄素、穿心莲成分API0134等对RS的预防亦显示出一定的作用[29-30]。发现大黄素可抑制正常动脉、硬化动脉及球囊损伤动脉壁的SMC增殖，主要机制为抑制细胞由G0期向S期转化。笔者研究显示大黄素对正常生长的VSMC抑制作用不明显，对增殖状态的VSMC有明显抑制作用，其机制与下调Wnt信号有关，其抗炎作用和下调Wnt通路之间可能存在的关联尚不清楚。某些具有抗血小板、抗凝作用的中药如水蛭素、去纤酶也被证实能够抑制内膜增殖[31]。

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2013-02-27）

（本文编辑：马雯娜）

浙江省卫生厅科研基金（2010KYA155）；浙江省中医药科学研究基金（2011ZA027）

310006 杭州，浙江中医药大学附属第一医院心血管科

华军益，E-mail：huajunyi1973@163.com