Ras信号传导通路与肿瘤的关系＊

徐艳朋(综述)，俞 松(审校)

(遵义医学院附属医院小儿矫形外科，贵州遵义 563099)

在肿瘤的发病机制中，一些信号传导通路的异常激活起着重要的作用，目前发现Ras信号传导通路与人类绝大多数肿瘤的发生、发展过程密切相关，该通路中的任何组分发生突变都会影响肿瘤细胞增殖、分化及凋亡，因此，对Ras信号传导通路的深入研究不仅对认识肿瘤的发生发展及预防有重要意义，而且还可以通过干扰该通路的过度激活而达到在基因水平上治疗肿瘤的目的。本文就Ras通路的激活以及与肿瘤的关系进行综述。

1 Ras信号通路的活化机制

1.1 Ras信号通路的概述 Ras信号通路也称Ras/Raf/MEK/ERK信号通路或ERK信号通路，是由一个小GTP结合蛋白连接活化的受体酪氨酸激酶和胞浆蛋白激酶级联反应。该通路是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase MAPK)众多通路中研究最多的一个，Ras信号通路主要由3种蛋白激酶构成:①MAPKK激酶Raf，可磷酸化并激活下游的MEK;②丝裂原活化蛋白激酶的激酶(Mitogen－activated protein kinase kinase)MEK，能够磷酸化并激活下游的ERK;③细胞外信号调节激酶(Extracellular signal regulated kinase)ERK，可磷酸化并激活多种下游底物。该通路是最重要的细胞传导信号通路之一，它不仅涉及细胞多种生理功能的调节，还在多种疾病的发病机制及病理生理过程中发挥着重要作用，甚至在我们的行为反应和认知方面，如学习、记忆等过程中，都起着关键的作用［1］。

1.2 Ras信号通路中各组分的结构与活化 Ras蛋白为只有一条多肽链的低分子质量的三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate，GTP)结合蛋白，包括两种构象:有活性的GTP结合构象和无活性的GDP结合构象，这两种构象在一定条件下可以互变，构成Ras循环。外源性刺激如生长因子(EGF、PDGF等)与胞膜上的受体结合，使受体上相应的酪氨酸残基磷酸化，磷酸化的酪氨酸残基与Grb2(growth factor receptor－bound protein 2)的SH2区结合后，招募鸟苷酸交换因子SOS蛋白与Grb2的SH3区结合，使SOS蛋白定位于细胞膜上，形成复合物Grb2－SOS，Grb2－SOS与 Ras结合使 Ras－GDP转变为Ras－GTP，Ras被激活;激活后的Ras促使下游的Raf活化，Raf蛋白激酶是由Raf基因编码的蛋白产物，是调控肿瘤血管生成的一个关键分子，在内皮细胞生存和血管生成过程中发挥重要的调节作用，共分为 A －Raf、B －Raf、Raf－1(或 C －Raf)三种亚类。与肿瘤细胞多种功能关系最为密切的是Raf－1，它的分子结构中含有3个保守区，其中第一个保守区CR1(61～194)是活化的Ras与Raf－1蛋白激酶结合的主要部位，激活后的Ras与其结合将使Raf－1固定于细胞膜内侧，然后由其它非Ras依赖的信号分子激活;Raf－1活化后，它的C端催化区能与MEK1/2结合，并使其催化区第VIII亚区中的双重磷酸化位点丝氨酸－xxx－丝/苏氨酸(S－xxx－S/T)发生磷酸化，从而导致它的活化［2］。活化的MEK再将细胞外信号调节激酶(ERK)激活，ERK被快速地转运入细胞核去磷酸化和激活 AP － 1、ELK －1、SAP、c－Jun、c－Fos、c－Myc等涉及增殖反应的转录分子，参与细胞生长、发育、分裂及分化等多种生理过程，并在肿瘤恶变中起重要作用。

2 Ras信号通路对细胞增殖的作用

细胞的存活取决于增殖与凋亡的平衡，Ras信号通路参与了细胞的增殖与凋亡的过程，与细胞的存活密切相关，早期的研究认为，Ras信号通路被激活后将促进细胞的增殖、分化，并抑制细胞的凋亡，即:细胞表面的受体活化后激活Ras通路，通过级联反应后活化ERK，活化的ERK可以诱导细胞周期蛋白D1(cyclinD1)及细胞周期蛋白E(cyclinE)的表达，cyclinD1通过与细胞周期依赖性蛋白激酶－4(CDK4)结合，使细胞由G0期进入G1期，cyclinE可以与细胞周期依赖性蛋白激酶－2(CDK2)结合，使细胞由G1期进入S期，从而加速细胞周期的进行，促进细胞的增殖等。但是现在越来越多的研究表明不同的外界刺激以及Ras信号通路激活的强度和持续时间不同会对细胞的增殖产生不同的效应，持续且强度适宜的激活对细胞增殖起到正性调控作用，过度激活能够诱导一种细胞周期抑制蛋p21cip1的表达，p21cip1与CDK4结合使细胞周期停滞在G0/G1期，与CDK2结合则使细胞停滞在G1/S期，进而抑制细胞的增殖，此外过度激活的Ras信号通路使cyclinD1积聚，过度积聚的cyclinD1可与细胞周期抑制蛋白p21cip1结合，使 p21cip1免受降解，导致细胞进入静息状态［3］。也能够间接导致ROS的激活进而参与细胞死亡效应。

3 Ras信号通路在肿瘤发病中的作用

目前研究表明在许多恶性肿瘤组织中均发现Ras通路的异常激活，如:McCubrey等［4］在黑素瘤、结肠癌、卵巢癌中等多种肿瘤中发现了Ras突变，Ras基因具有抑制肿瘤的功能［5］，它的单点突变足以引发恶性转化［6］，另外突变的B－Raf蛋白第600位缬氨酸残基转变为谷氨酸残基(V600E)，导致下游MEK和ERK的异常活化，引起细胞增殖。其他的研究表明Raf－1、MEK、ERK在瘤体组织中的表达量高于正常组织，由此可见该信号通路在肿瘤的发生、发展中起着重要的作用。当外界适当的刺激激活Ras信号通路后，Ras不仅可以募集Raf－1定位于细胞膜上，它和体内钙离子水平也能调节血管生成［7］。Raf－1被激活后可以继续激活下游分子，同时Raf－1本身也有独立于MEK、ERK的作用，其一，Raf－1与凋亡相关激酶作用而抑制肿瘤细胞凋亡;其二，Raf－1还参与其他多种细胞生物学过程的信号传导及调控，是多种信号途径的一个交联点(如:Raf－1还参与G蛋白相关信号途径)［8］，它的活化可以更广泛的、多途径的引起细胞增殖;其三，Raf－1可上调血管内皮细胞生长因子的表达，刺激肿瘤血管的生成。Raf－1的这些作用均能促进肿瘤的发生、发展及转移等。MEK不仅能够激活ERK，并在生理条件下维持ERK的活化［9］，其本身也有促细胞增殖、分化及加速细胞周期进展的作用。ERK被磷酸化，呈激活状态(p－ERK)，并在调节细胞形态改变、细胞迁移、粘附及向周围间质扩展中发挥重要功能［10］。首先，p－ERK可以引起cyclinA和cyclinD1高表达，cyclinA激活Cdc2－cyclin进而增加细胞的增殖能力，同时cyclinD1促进异源二聚体形成，导致Rb基因失活，上调cyclinE的表达，也可以使细胞的增殖能力增加，p－ERK本身在一定程度上影响着细胞G1期遗传的不稳定性，缩短细胞周期，最终引起肿瘤的发生。其次，p－ERK可以上调Mdm的表达，引起p53基因失活，使细胞无法修复DNA损伤，进而引起了肿瘤的发生。再次，p－ERK使H3快速乙酰磷酸化，并激活c－jun、c－fos等，cjun、c－fos等异常表达又可以促进细胞由G1期进入S期，同时增加AP－1的表达，引起肿瘤的发生。最后，活化的Erk1/2可以促进Bcl－2的表达，抑制Cty c的释放，维持线粒体的功能，抑制凋亡的发生［11－12］。此外，p－ERK 可以增加 NF －kB的表达及上调MMP，NF－kB促使Cox－2及PGE2的表达增加，发挥炎症介质的作用，诱导肿瘤发生［13］，另有研究表明ERK在MMP－9的基因表达中起作用［14］，MMP作为一类促血管生成因子，可以促进肿瘤血管内皮细胞增殖，引起肿瘤细胞的侵袭、转移等，导致肿瘤的进一步发展。

4 Ras信号通路与肿瘤治疗的现状

大量的研究表明Ras信号通路在肿瘤的发病中起着重要的作用，其治疗肿瘤的手段也开始着重从直接或间接抑制Ras信号通路的作用方面入手，并在某些领域取得较大的进展。

4.1 Ras基因靶点抑制剂 目前研究最多的是法尼基移酶抑制剂(farnesyltransferase inhibitors，FTIs)，主要包括 tipifarnib、lonafarnib和 BMS－214662。作用机制是通过抑制法尼基转移酶将法尼基结合到p21Ras羧基端的半胱氨酸(Cys)残基，Cys残基不能被羧甲基化，p21Ras就不能定位在细胞膜上，Ras不能被激活，从而抑制了Ras信号通路的传导与肿瘤的发生。tipifarnib是一种口服剂，临床上大多与其他药物联合应用，能产生协同作用，达到较好的治疗效果。如:在过表达P－糖蛋白(permeability－glycoprotein，P－gp)的白血病细胞株CCRF－CEM和KG1a中，tipifarnib与柔红霉素(daunorubicin，DNR)联合，能抑制P－gp介导的蒽环类药物流出效应，增强细胞对DNR的敏感性［15］。tipifarnib还可以与其他药物联合，治疗急慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、多形性成胶质细胞瘤等。Lonafarnib为另外一种法尼基转移酶抑制剂的口服剂，有研究证实在卵巢癌肿瘤移植模型中，lonafarnib与紫杉醇联合使用和紫杉醇单药相比，可导致肿瘤体积明显消退(P ＜0.01)［16］。BMS －214662 是苯二氮卓类衍生的一类FTIs，当与其他化疗药物联合应用时可诱导增殖期和静止期的肿瘤细胞凋亡［17］。FTS是人工合成的法尼基半胱氨酸类似物，不仅可以阻碍Ras蛋白锚定在细胞膜上，也可以解除这种锚定作用，同时将Ras蛋白悬停在细胞质中，促使其加快降解进而减少活化的Ras蛋白水平，最终降低癌症的发生率［18］。此外还有抗p21Ras单克隆抗体，应用抗p21Ras单克隆抗体Y13－259经显微注射入血清依赖性的NIH3T3细胞内能阻止血清诱导的NIH3T3细胞进入S期，并且能使由活化的H－Ras诱导的细胞恶性表型发生逆转［19］。

4.2 Raf激酶抑制剂的研究 通过抑制Raf激酶来达到治疗肿瘤的目的:①Raf激酶抑制蛋白(RKIP)，它是一种在正常组织中也能够表达的蛋白，并参与Raf转导通路的调节，RKIP能与Raf－1结合，从而抑制Raf－1介导的MEK磷酸化和活化［20］，下调下游信号分子的表达，一些恶性肿瘤的发病正是由于RKIPmRNA及蛋白的表达水平下调而引起。RKIP还参与了蛋白激酶C(PKC)对Raf－1的活化作用，PKC可通过磷酸化RKIP(Ser－153)从而减弱 RKIP对Raf－1的抑制［21］。研究人员曾用RKIP基因转染肝细胞癌细胞系，发现RKIP表达水平增高，Raf激酶活性下降，这给予我们启示:或许将来能够利用分子手段将RKIP基因直接转染恶性肿瘤细胞来达到治疗的目的。②苯并咪唑类化合物:Raf265［22］(Novartis)是一种口服的有效的Raf激酶小分子抑制剂，对三种 Raf亚型均可抑制，并抑制VEGFR－2激酶的活性来破坏肿瘤血管的生成。另外其他系列的苯并咪唑类化合物对Raf－1活性有较好的抑制性，甚至有些对其的抑制活性 IC50值达到了 0.14μmol/L［23］。目前这类药物已经应用于临床，并取得了较好的疗效。③脲类Raf激酶抑制剂:Sorafenib是口服多靶点酪氨酸激酶抑制剂，该药已应用于临床，主要治疗肾细胞癌，并在临床研究中证实对早期肝癌有较好的疗效，并能够延长晚期肝癌患者的寿命，现已成为成人肝细胞癌的治疗用药［24］。④双芳基咪唑类化合物:L－779450能阻断细胞中血清依赖型MAPK的磷酸化［25］，实验研究表明 L－779450能抑制结肠癌、肺癌、恶性黑素瘤等在内的多种肿瘤细胞的增殖。⑤其他:如噻吩并吡啶类化合物不仅对TNF－α、PDE4显示出了较好的抑制活性，同样也显示出了 B － Raf抑制活性［26－27］。反义核苷酸ISIS5132［28］，它是一种含有20个碱基的反义寡核苷酸，通过RNA酶(RNaseH)可降解Raf－1mRNA，减少 Raf－1 蛋白的合成［29］，并在恶性肿瘤裸鼠移植模型中得到了证实。此外还有ZM －336372、噻唑类衍生物、SB－590885、PLX4032、吲哚酮类化合物 GW －5074、B－Raf激酶 ATP 竞争性抑制剂 CS292、CS240［30］等。

4.3 MEK激酶抑制剂的临床研究及应用 MEK抑制剂主要包括 U0126、PD98059、PD184352、PD032 5901、AZD6244等。U0126是一种高选择性和高效的MEK阻滞剂，其最佳有效浓度30umol/L，通过直接抑制ERK1/2的上游激活物MEK的活性而阻滞ERK1/2的磷酸化，从而阻断刺激信号向核内传递。动物实验表明应用MEK抑制剂U0126后，S期细胞比例和DNA合成显著减少，体外集落形成大幅下调，裸鼠体内移植瘤体积缩小。PD98059可以抑制MEK的磷酸化，阻断其下游激酶ERKI/2的活化，从而影响肿瘤细胞的生长、侵袭和转移。PD184352是一种口服的高效MEK抑制剂，PD0325901与之为同源物，它们与雷帕霉素、紫杉醇等化疗药物联合应用时可增强药物的疗效，下调凋亡抑制蛋白Bcl－xl，抑制肿瘤细胞的增殖及癌细胞蛋白质的合成等。AZD6244主要作用于MEK激活这个环节，使MEK虽能结合ATP和底物，但不能活化［29］，进而MEK不能发挥作用，抑制了肿瘤的发展。此外，AZD6244与伊立替康或多西紫杉醇联合应用与单药相比都显示了可增强抗肿瘤效应［31］，说明AZD6244还具有协同抗肿瘤作用。

4.4 ERK激酶抑制剂治疗肿瘤的临床研究ERK抑制剂apigenin能够减弱5－HT通过Ras信号通路促进肾系膜细胞内TGF－β1mRNA的表达，来减轻肾小球硬化进展［32］。治疗宫颈癌运用最广泛的化疗药物顺铂的抗癌作用及耐药又常常涉及ERK1/2信号转导通路的激活［33］。此外，从分子角度考虑，亦可人工合成一段肽，竞争结合ERK在MEK上的结合位点，抑制ERK的活性［34］，达到治疗肿瘤的目的。

5 展望

经过几十年的研究，人们对 Ras信号通路的研究已经取得了较大进展，不仅对该通路各个组分的结构、功能和整个通路的活化机制有了透彻的了解，更对其与肿瘤发病机制之间的关系有了深入的研究，在一些恶性肿瘤中，如肝癌、胃癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、鼻咽癌、胆管癌、急慢性髓细胞性白血病等，均发现了Ras信号通路的异常激活，并在此基础上研发出了通过干预Ras通路而达到治疗肿瘤的药物，部分已应用于临床。但是肿瘤的发生并不是简单的一个通路的激活引起的，并且Ras通路也与其他通路及因子之间有着密不可分的联系，只有将这些引起肿瘤发病的因素作为一个整体来分析，才能更好解决肿瘤的治疗问题，甚至更好预防肿瘤的发生，防患于未然。

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