星形胶质细胞Cx43 及缝隙连接通讯与缺血性脑卒中关系的研究进展

孙 嫄综述，冯加纯，邓 方审校

星形胶质细胞是脑组织中数量最多的细胞，存在大量的缝隙连接蛋白(connexin，Cx)，在哺乳动物中以Cx43 为主。近年来国内外大量研究对星形胶质细胞Cx43 及其半通道、缝隙连接(gap junction，GJ)在缺血性脑卒中的作用意见不一，本文将探讨目前这方面的研究情况。

1 Cx43、半通道及缝隙连接的基本结构与生理特性

目前已发现Cx 达21 种，脑内存在13 种。根据其来源、在核苷酸和氨基酸序列上的相似程度，可分为α 群:Cx33、Cx37、Cx40、Cx43、Cx45、Cx46、Cx50、Cx57 和β 群:Cx26、Cx30、Cx31、Cx32，以及由神经元表达的γ 群--Cx36。所有这些Cx 均由同一基因家族所编码，因而不同Cx 具有高度一致的结构特征。例如，Cx 氨基末端和羟基末端均存在于细胞质内，它们都具有4 个疏水的跨膜区、中间的亲水段、2 个胞外环和l 个胞内环。其中氨基末端、4 个跨膜区和2 个胞外环都是高度保守区域，而羟基末端和胞内环则决定了Cx 结构的种属特异性［1］。所以不同的Cx 具有不同的功能性质，如:电压敏感性、渗透性等。不同类型细胞表达的缝隙连接蛋白也会不同，有些细胞可特定表达某些缝隙连接蛋白，如Cx30 和Cx43 可作为星型胶质细胞的标记物，Cx32 和Cx45则可作为少突胶质细胞的标记物。

星形胶质细胞存在大量的Cx，其中以相对分子质量为43kD 的Cx43 为主。6 个Cx 通过非共价键规律排列成的一个中空的亲水连接子，成对的连接子在细胞膜处紧密相连形成GJ;而细胞膜上未配对的连接子，即半通道存在于缝隙连接周边的非连接区胞膜上，主要调节细胞内Ca2+、ATP、NAD+水平，是细胞内外物质通讯的直接通道。生理情况下，GJ 处于开放状态，允许相对分子质量小于1.5 kD 的分子，如第二信使、葡萄糖、谷氨酸、离子等代谢产物在细胞间进行交换，发挥缝隙连接通讯(Gap junctional intercellular communication，GJIC)功能。而半通道则处于关闭状态或仅有极少量开放。这可能是因为构成GJ 的Cx43 已发生磷酸化，而单独存在的半通道Cx43 和胞浆内的Cx43 并未有上述改变。

星形胶质细胞籍由GJ 可形成一个网络式的功能合胞体，与远隔区域的兄弟细胞形成分子联系，与其相互呼应，在维持内外环境稳定、协调神经元功能、调节神经细胞的分化、发育中起重要作用［2］。另外胶质细胞的多种重要功能都与缝隙连接有关。譬如，星型胶质细胞的终足包裹着血管，提供神经元营养物质，而星型胶质细胞之间的缝隙连接更有利于其靠近脉管结构。而且，缝隙连接也被认为在髓鞘的产生和维持上起着重要作用。最近研究发现在海马突触传递、突触可塑性及记忆认知功能的调节中，胶质细胞缝隙连接也起到重要作用。

2 Cx43、半通道及GJ 与缺血性脑卒中的关系

缝隙连接不仅存在于胶质细胞间，还架起了神经元与胶质细胞间的桥梁，在神经系统的信号传递及各种反应中发挥重要作用。有研究者发现神经胶质细胞自身可进行无氧代谢，因此比神经元更能耐受缺氧［3］。但一些本不足以影响神经胶质细胞的缺血事件却可导致其功能降低，推测这种损伤是继发于神经元死亡，GJ 在此起重要作用［4］。

2.1 Cx43 与缺血性脑卒中 生理条件下，星形胶质细胞Cx43 大多处于磷酸化状态。研究证实缺血缺氧使Cx43去磷酸化，蛋白构象发生了变化，继而引起功能变化。但Cx43 蛋白总量是否变化存在争议。邓方［5］通过星形胶质细胞体外缺氧模型发现Cx43 蛋白总量未见明显变化，但分布变化明显，缝隙连接出现一过性降低。Hugyecz［6］却在全脑缺血模型后3 天发现Cx43 表达增加。分析可能由于模型不同，一方面细胞所处的内环境不同，另一方面体外实验观察的星形胶质细胞相当于缺血中心区，而体内实验观察的脑组织则不一定就是缺血中心区，这些因素可能导致上述二者之间差异。Hossain 等［7］在夹闭双侧颈动脉诱发轻度全脑缺血模型中，观察到海马和纹状体Cx43 免疫反应性增高。重度全脑缺血模型中发现缺血中央区CX43 免疫反应性减弱，在其周围即半暗带Cx43 免疫反应性增强。在急性MCAO 模型中，缺血1、24h 后再灌注，发现在纹状体、大脑皮质缺血中央区Cx43 缺失，而在半暗带仅有少量CX43。说明不同程度脑缺血损伤时，Cx43 蛋白表达在空间和时间上也不同。

有研究指出，Cx43 不仅存在于细胞膜上，还存在于线粒体和细胞核等细胞器中。在损伤机制中，很多研究证实了Cx43 参与神经细胞凋亡。例如，存在于线粒体的Cx43，可以调节线粒体细胞色素C 释放从而调节细胞凋亡。存在于细胞核内的Cx43 可能不依赖于GJ，而通过其C-末端调控基因表达促进细胞凋亡。Cotrina 等［8］研究发现，模拟缺氧缺血模型的脑片及细胞培养，Cx43 表达增多，GJ 功能增强导致细胞凋亡增加，脑损害加重。林洁英［9］在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤研究中也发现，缺氧缺血组皮质、海马区域Cx43 表达量在各时相点均高出对照组，其变化规律与神经细胞凋亡、脑组织病理改变严重程度的时间窗吻合，且Cx43 发生变化开始时间早于细胞凋亡，提示星形胶质细胞Cx43 表达的增强可能参与了新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的病理形成过程。推测可能机制为表达增多的Cx43 及其GJ 迅速跨膜传导代谢有害物质进入周边细胞，加重半暗区的凋亡及病理恶化，导致脑损伤的加重。韩冬［10］通过应用RNA 干扰技术抑制星形胶质细胞Cx43 合成，进而减少缝隙连接半通道及通道形成，导致凋亡的细胞减少，说明抑制缝隙连接蛋白可以起到抗凋亡的作用。

近年来也有研究报道Cx43 在缺血再灌注中对大脑神经元起保护作用。有研究表明，过量表达的Cx43 本身可以保护胶质细胞免受损伤，而使用GJ 阻断剂并没有使这种作用消失;在急性脑缺血再灌注损伤时，吸入氢可提高Cx43 的表达水平，从而减少缺血再灌注对神经元的损伤［11］。Orellana等［12］把Cx43 作为治疗缺血再灌注损伤的新靶点，实验中发现阻断Cx43 半通道表达可减少神经元的独立生存能力，说明合理调控Cx43 的表达可预防大脑神经元缺血再灌注损伤。Michael［13］等发现Cx43 的C-末端在通道活性中扮演重要角色。相同程度的缺血应激后，敲除了C-末端的大鼠与对照组相比，脑损伤加重，缺血半暗带扩大。提示Cx43 的C-末端在缺血性脑损伤中起重要的保护作用。

Cx43 在缺血预处理(ischemia preconditioning，IP)中也发挥重要作用。实验发现IP 减少了由缺血再灌注诱发的心肌细胞膜和线粒体Cx43 的降解和脱磷酸化，维持了心肌细胞Cx43 mRNA 和细胞膜、线粒体蛋白Cx43 的表达水平，维持了缝隙连接的基本结构，从而有效地减少缺血再灌注对心肌的损伤［14］，同时可以通过激活PKC 激酶维持磷酸化Cx43 的水平，关闭缝隙连接通道，减少死亡因子的扩散来发挥缩小心肌梗死范围的作用。IP 可通过开放线粒体敏感性钾通道使心肌缺血时Cx43 磷酸化，抑制其内化。可通过上调Cx43mRNA 表达量，来减少缺血/再灌注引发细胞肿胀程度。由此可见，Cx43 在IP 的心肌保护作用中极为重要。但目前国内外缺乏GJ 在缺血预处理脑保护中作用的相关研究，此方向有待深入探索。

2.2 半通道与缺血性脑卒中 有研究报道，脑缺血使Cx43 去磷酸化诱导半通道开放，但Cx43 半通道开放量的增加与氧化作用和嵌入细胞膜的Cx43 半通道增多有关，与半通道Cx43 去磷酸化无关。

半通道开放可通过介导细胞凋亡使脑损伤加重［15］。最初发现半通道开放现象是在过表达Cx 46 的爪蟾卵母细胞上，如果不施加高Ca2+关闭此通道，这些卵母细胞很快就死亡。Orellana［16］发现促进Cx43 半通道的表达，可增加胞内储存的Ca2+离子的释放，说明Ca2+离子通道的活动度与Cx43半通道开放有关。通常认为，Ca2+稳态失衡被视为细胞死亡的最终通路。朱丽萍［17］研究发现缺血/缺氧情况下，Cx43 及Cx43 半通道的表达增加，缝隙连接及半通道的开放增多，增加了细胞间的偶联程度，引起的Ca2+超载及Ca2+波扩散诱导了细胞调亡，使细胞死亡增多，梗死体积扩大。推测可能机制为:半通道开放数增大后，一方面可造成自身细胞的离子紊乱(细胞内Ca2+超载，K+减少)及代谢失衡(ATP、NAD+、谷氨酸大量释放)，促进细胞死亡。另一方面释放的ATP、NAD+等物质，通过旁分泌作用于临近细胞刺激产生IP3 及环腺苷二磷酸核糖(Cyclic Adenosine Diphosphate Ribose，cADPr)，二者通过调节内质网Ca2+通道，使包浆内Ca2+急剧增加，同时，通过缝隙连接向周围细胞进行传递，过高的Ca2+和IP3 则可引起星形胶质细胞及远隔的神经元异常兴奋，激活钙依赖性的磷酸酶、蛋白酶、ATP 酶、核酸内切酶等，最终引起细胞死亡。

半通道与缺血后脑水肿也存在一定关系。半通道可通过调控细胞体积影响细胞对损伤的反应，机制为谷氨酸可通过缝隙连接半通道释放到细胞外，而谷氨酸的大量释放，能通过其受体发挥神经元兴奋性毒性作用，引起或加重颅脑损伤后脑水肿。

研究发现，通过膜片钳和生物荧光技术检测出CX43 半通道可以通透ATP。Cx43 在缺血状态下表达显著增加，半通道开放相应增加，经其流出的ATP 迅速降解为阿糖胞苷，通过其A1 受体介导减轻缺血损伤;另外阿糖胞苷舒张血管作用也可对缺血半影区起很强的保护作用。因此半通道的通透性增加是保护还是加重细胞损伤目前尚不清楚。

2.3 GJ 与缺血性脑卒中 脑缺血情况下，Cx43 缝隙连接发生改变，同时缝隙连接细胞间通讯在组织损伤和细胞死亡过程中又具有双重作用。

有学者发现，转染胸苷激酶的细胞会死亡，而邻近未转染胸苷激酶的细胞也相继出现死亡，推断这种“旁观者死亡效应”与GJ 密切相关。1996 年，States 等提出大鼠海马区血供并不来自大脑中脉，但永久性大脑中动脉阻塞后，50%的动物出现海马CA1区神经元不可逆损伤甚至死亡。有学者将大鼠大脑皮质星形胶质细胞分离纯化后在体外空气含糖环境中培养，待细胞融合后置于＜1%02饱和度的缺氧无糖环境中，观察发现细胞间有染料耦联。这些实验证实，在缺血缺氧环境中星形胶质细胞处于开放状态，具有介导细胞间通讯的功能，从而导致CA1区细胞死亡。

唐颖馨［18］利用MCAO 模型，选用缝隙连接阻断剂甘珀酸来研究缝隙连接通讯后海马迟发性神经元死亡的影响。结果表明，阻断缝隙连接通讯可有效减小梗死面积及海马区迟发性神经元死亡发生率。Frantseva 通过体外制备海马区脑组织缺血模型，发现在缺血后48h 应用甘珀酸抑制细胞间GJ 可有效减少细胞死亡数，证明了脑缺血再灌注后神经元的损伤程度与星形胶质细胞GJ 的数量与密度呈正相关。在急性脑缺血时，一方面，GJ 使得周围细胞间形成代谢耦联，因而缺血中心的垂死细胞除引起自身死亡外，发出的凋亡信号可能通过星形胶质细胞传递到半暗带区，从而启动了半暗带区细胞的凋亡程序;另一方面，由缺血中心区钾离子和兴奋性氨基酸释放所引起的自发性梗死周围去极化可能导致半暗带区细胞损伤，而研究表明GJ 参与了梗死周围去极化的形成;最后，在缺血情况下缺血中心区细胞内的ATP 迅速消耗，GJ 可能顺浓度差将能量由半暗带区送到中心区内垂死的细胞，导致更多的细胞因能量短缺而受损。因而认为抑制Cx43 可能通过抑制缝隙连接通讯从而发挥神经保护。

但既往也有研究证实，局部脑缺血事件后，Cx43 基因敲除鼠比对照组脑梗死面积明显增加，细胞凋亡数目增大［19］。在体外混合培养的星形胶质细胞与神经元中，无GJ 耦联的细胞对缺氧和谷氨酸毒性的耐受性比有GJ 耦联的细胞明显减弱，脑缺血后神经元的损害较严重。这些结果提示GJ 对缺血脑组织有潜在的保护作用。脑组织缺血缺氧损伤后，星形胶质细胞GJ 处于开放状态，可介导细胞间通讯，及时清除有害物质Ca2+、谷氨酸等，保护脑组织，还可为为梗死区神经元提供ATP、糖类等营养物质，支持受损神经元，减慢脑损伤的扩散。

3 缝隙连接阻断剂与缺血性脑卒中

缺血性卒中是人类致死的主要原因和成人致残的首要原因。缝隙连接活动可加剧并参与脑缺血的损伤过程，缝隙连接阻断剂能够抑制缝隙连接胞间通讯，减轻缺血/再灌注对胶质细胞的损伤，同时对缺血区及远隔区神经元起到了一定的保护作用，有效地减少梗死体积，这为缺血性卒中的治疗提供了新的思路。

目前发现多种物质可以抑制缝隙连接。但研究多数以Cx43 本身的结构、生理功能、在电生理中的作用为主。作用靶点为连接蛋白的药物较少，常见的有3 大类［20］:第一类为缝隙连接耦联抑制剂，多为亲脂性药物，如庚醇、辛醇、甘珀酸、全反式维甲酸和油酸酰胺等，主要机制是通过掺入脂质双分子层破坏缝隙连接的功能;第二类为缝隙连接耦联激动剂，目前有抗心律失常肽一种;第三类为影响蛋白本身生理过程的药物，如他汀类药物，这类药物通过不同途径影响连接蛋白的合成、装配、定位、降解，也是3 大类药物中惟一一类正式进入临床的药物。但这些缝隙连接阻断剂不仅在不同种属和器官间存在较大差异，而且有的还存在较严重的副作用。因此，找到一种强效、特异和可逆的缝隙连接阻断剂对于治疗心、脑血管疾病是十分必要的。有学者发现利用Cx 细胞内、外结构的相对应的短肽序列可产生抗原表位的特异性抗体，能够更有针对性的研究缝隙连接的结构及功能［21］。例如，Cx43 两个胞外环中的短肽模拟物Gap26 及27已作为生物探针，特异性阻断GJIC。有学者［22］利用有靶向功能的Cx43 C-末端合成短肽模拟物Gap19N，Gap19N 能够与C-末端结合，阻断了分子内C-末端的相互作用，针对性抑制细胞膜上的半通道，而不抑制GJ，这类肽模拟物可选择性阻止半通道开放，通过降低半通道开放率减轻缺血性损伤，可作为缺血性心、脑系统疾病的一种研究方法。

4 展 望

综上所述，星形胶质细胞GJ 与缺血性脑卒中的损伤程度确实相关。然而，星形胶质细胞GJ 究竟加重还是减弱了缺血性脑卒中的损伤，目前难以明确。阐明Cx 及其介导的缝隙连接的通讯功能及在脑缺血损伤与作用，有助于进一步理解胶质细胞参与脑缺血的病理机制。以缝隙连接蛋白作为新的设计靶点，有助于探索缺血性脑卒中的新型治疗方法。

［1］Kumar NM，Gilula NB.The gap junction communication channel［J］.Cell，1996，84:381－388.

［2］Bikou O，Thomas D，Trappe K，et al.Connexin 43 gene therapy prevents persistent atrial fibrillation in a porcine model［J］.CardiovascRes，2011，92(2):218－225.

［3］Peuchen S，Duchen MR，Clark JB.Energy metabolism of adult astrocytes in vitro［J］.Neuroscience，1996，71(3):855－870.

［4］Chen Y，Swanson RA.Astrocytes and brain injury［J］.Cerebra Blood Flow Metab，2003，23(2):137－149.

［5］邓 方.局灶性缺血性脑卒中星形胶质细胞缝隙连接功能的变化及其意义:体内体外研究［D］.吉林:吉林大学，2004.

［6］Hugyecz M，Mracsko E，Hertelendy P，et al.Hydrogen supplemented air inhalation reduces changes of prooxidant enzyme and gap junction protein levels after transient global cerebral ischemia in the rat hippocampus［J］.Brain Res，2011，1404:31－38.

［7］Hossain MZ，Peeling J，Sutherland GR，et al.Ischemia-induced cellular redistribution of the astrocytic gap junctional protein connexin43 in rat brain［J］.Brain Res，1994，652:311－322.

［8］Cotrina ML，Kang J，Lin JH，et al.Astrocytic gap junctions remain open during ischemic conditions［J］.Neurosci，1998，18(7):2520－2537.

［9］林洁英，林霓阳，黄 广.Cx43 在缺氧缺血新生大鼠脑组织中的表达及意义［J］.中国现代医生，2007，45(8):18－20.

［10］韩 冬，冯加纯，薛 晶，等.RNAi 抑制星形胶质细胞Cx43 对缺氧/再复氧后细胞凋亡的影响［J］.中风与神经疾病杂志，2010，27(9):785－787.

［11］Hugyecz M，Mracsko E，Hertelendy P，et al.Hydrogen supplemented air inhalation reduces changes of prooxidant enzyme and gap junction protein levels after transient global cerebral ischemia in the rat hippocampus［J］.Brain Res，2011，1404:31－38.

［12］Orellana JA，Hernondez DE，Ezan P，et al.Hypoxia in high glucose followed by reoxygenation in normal glucose reduces the viability of cortical astrocytes through increased permeability of connexin 43 hemichannels［J］.Glia，2010，58(3):329－343.

［13］Michael G，John F，Geralyn R，et al.The Connexin43 C-Terminal region mediates neuroprotection during stroke［J］.Neuropathol Exp Neurol，2010，69:196－206.

［14］刘人宁，曾志羽，钟国强，等.缺氧预处理对离体心肌细胞膜和线粒体缝隙连接蛋白43 表达的影响［J］.广东医学，2013，34(4):509－511.

［15］Contreras JE，Bukauskas FF，Bennett MV，et al.Metabolic inhibition induces opening of unopposed connexin 43 gap junction hemichannels and reduces gap junctional communication in cortical astrocytes in culture［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(1):495－500.

［16］Orellana JA，Soez PJ，Cortes-Campos C，et al.Glucose increases intracellular free Ca2+in tanycytes via ATP released through connexin43 hemichannels［J］.Glia，2012，60(1):53－68.

［17］朱丽萍.Cx43 及Cx43-hemichannel 在大鼠全脑缺血再灌注损伤中的作用［D］.山东:山东大学医学院，2012.

［18］唐颖馨，徐沙贝，易陈菊，等.阻断缝隙连接通讯对局灶性脑缺血后海马迟发性神经元死亡及脑梗死体积的影响［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2009，18(1):64－70.

［19］Siushansian R，Bechberger JF，Cechetto DF，et al.Connexin43 null mutation increases infarct size after stroke［J］.J of Comparative Neurology，2011，440(4)，387－394.

［20］焦华琛，刘春英，郭 丽.缝隙连接蛋白43 与心律失常关系的研究进展［J］.实用心脑肺血管病杂志，2013，21:36－37.

［21］Evans WH，Bultynck G，Leybaert L.Manipulating Connexin Communication Channels:Use of peptidomimetics and the translational outputs［J］.Membrane Biol，2012，245:437－449.

［22］Wang N，Elke DV，Raf P，et al.Selective inhibition of Cx43 hemichannels by Gap19 and its impact on myocardial ischemia/reperfusion injury［J］.Basic Res Cardiol，2013，108(1):309－335.