溃疡性结肠炎中西医动物模型研究进展

徐 阳，唐艳萍

溃疡性结肠炎的病因至今未明，可能与感染、免疫、遗传、环境等多种因素相关。患者病情常常迁延不愈，且极容易复发，因此对溃疡性结肠炎的深入研究非常重要。溃疡性结肠炎的发病机制、疾病发展规律以及相关治疗药物的研究与开发，都以动物模型为基础，选择建立操作简单、临床相似度高、稳定的动物模型对后续的实验研究至关重要。溃疡性结肠炎的实验动物模型建立方法有很多种，大致可分为免疫法、化学法、复合法、基因模型以及中医模型五大种类。这些动物模型的建立方法各有优劣，本文对溃疡性结肠炎动物模型逐一介绍，并对其优缺点进行评价，除此之外还介绍我们自己的动物模型经验及改良方法。

1 免疫法

免疫法建立溃疡性结肠炎模型的原理都是利用同种或异种的异体组织致敏，但在造模方法上，抗原来源和模型处理各不相同，具体方法主要包括：结肠黏膜组织致敏模型、胎鼠结肠种植模型、大鼠结肠细菌菌株模型。免疫法建立溃疡性结肠炎模型，症状相对较轻，且多为慢性炎症，故而所需要的实验周期较长，但与人溃疡性结肠炎的临床症状比较相似，对于抗溃疡性结肠炎的新药筛选，有一定意义[1]。

1.1 结肠黏膜组织致敏模型 可选用同种异体或异种异体，即利用其他大鼠或者其他动物的结肠黏膜组织所制成的匀浆，冷冻24 h，融冻后3000 r/min 离心30 min，提取上清液提纯，并测定蛋白含量，使用上清液前应加入Frend 佐剂，分别于第1 d、第10 d，在大鼠足垫内注射上清液0.1～0.3 mL，第17 d，大鼠背部注射上清液0.1～0.3 mL，第24 d，大鼠腹股沟处注射上清液0.1～0.3 mL，第30 d腹腔注射注射上清液0.1～0.3 mL（此时上清液中不加佐剂），腹腔注射5 d后，大鼠可产生类似临床溃疡性结肠炎症状[2]。

本方法的优点在于稳定性好、临床相似度高，但实验周期过长，需要一定实验设备和实验技术支持。

1.2 胎鼠结肠种植模型 受孕14～16 d的孕鼠，处死后取胎鼠结肠3～4 cm，以胎鼠结肠为抗原，无菌手术移植至同系的成年鼠肾包膜下，术后正常饲养7 d，可产生典型的细胞免疫反应，也就是宿主的抗移植反应，解剖结肠可见炎性反应，20 d后可见典型溃疡性结肠炎形成[3]。

本方法可以模拟临床上溃疡性结肠炎的慢性炎症反应病程[4]，在模型建立过程中，自身抗体所起到的重要作用，可以帮助分析溃疡性结肠炎病因中免疫因素所起到的作用。但是该模型需要严格的无菌操作，技术难度高，成功率低，造模周期长。

1.3 大鼠结肠细菌菌株模型 大肠杆菌为正常肠道菌群，将其作为抗原，诱导大鼠产生免疫反应。可取健康大鼠结肠内容物，37℃24 h细菌培养。取典型细菌扩增，鉴定确定为大肠杆菌后，利用福尔马林杀死细菌，并用生理盐水冲洗2～3次，制备混悬液。首次大鼠足垫内注射混悬液0.2 mL，第10 d腹部皮下注射0.4 mL，第17 d背部皮下注射0.6 mL，第24 d腹腔注射1.2 mL。三周后大鼠可出现黏液便、血便、病理组织学改变等，类似临床溃疡性结肠炎的变化，并逐渐加重，一月后即可出现典型溃疡性结肠炎症状，同时还有循环免疫复合物的增加以及细胞免疫功能低下等现象的发生[5]。

本方法抗原较易获得、实验成本低，同时也佐证发病机制假说中肠道正常菌群失调诱发溃疡性结肠炎的肯能性，是较好的病因学研究模型。但本实验的实验周期较长，并且需要实验器材制备大肠杆菌混悬液。

2 化学刺激法

化学刺激法因其实验成本低、操作简单、成功率高且在短期内可出现明显症状，故在溃疡性结肠炎的动物研究中属于应用较为广泛的模型，但以化学药物刺激动物结肠黏膜，造成动物结肠黏膜及血管损伤，与临床上溃疡性结肠炎的病因具有较大的差异，且模型自愈性极强，故而对实验研究具有局限性，不适合用于抗溃疡性结肠炎药物的疗效观察，但对结肠炎症病变的愈合等机制研究仍具有一定意义。

2.1 聚糖硫酸钠模型 对大鼠灌服由蔗糖合成的一种硫酸多糖体-聚糖硫酸钠，可以诱发溃疡性结肠炎。聚糖硫酸钠可以导致肠道菌群失调，肠道黏膜屏障破坏以及巨噬细胞功能紊乱[6]，并且对大鼠的结肠上皮产生毒性作用，可以建立类似临床溃疡性结肠炎的大鼠慢性结肠炎症模型。大鼠灌服3%聚糖硫酸钠溶液连续10 d，大鼠结肠黏膜可出现充血、水肿、糜烂及溃疡，与人类溃疡性结肠炎相似。大鼠长期饮用1.5%的聚糖硫酸钠溶液，可造成持续6周以上的慢性溃疡性结肠炎。

聚糖硫酸钠模型模拟溃疡性结肠炎造模方法简单，且聚糖硫酸钠灌服大鼠所诱导的溃疡性结肠炎模型，还可发生不典型增生和结肠腺癌，故而在探讨溃疡性结肠炎发病过程中肠道菌群失调、巨噬细胞功能紊乱以及结肠炎正相关不典型增生和癌症发生机制的研究具有极为重要的意义。

2.2 角叉菜胶模型 角叉莱胶是一种硫酸多糖，多于红海藻中提取，能够对结肠细胞造成损伤，导致结肠黏膜通透性增强。配置3%角叉菜胶溶液灌饮豚鼠，一周后动物开始出现体重减轻、腹泻、黏液脓血便，14 d 后解剖豚鼠结肠，可见溃疡和出血灶；病理观察结肠黏膜及黏膜下层炎性细胞包浸润，类似临床溃疡性结肠炎表现[7]。

该模型病变仅局限于结肠和直肠，在停止灌饮角叉菜胶后，结直肠炎症仍可持续10～14 d，能相对较好模拟慢性病程，但该模型一般所选用的豚鼠造价较高。

2.3 恶唑酮模型 恶唑酮是一种经典的半抗原物质[8]，是染料、农药等的重要中间体。经研究发现，恶唑酮对大鼠灌肠，可以诱导小鼠溃疡性结肠炎模型生成。在此模型中，细胞因子可过量分泌白细胞介素4，故而属于Th2 亚型炎症反应。将小鼠麻醉后，用恶唑酮溶液对小鼠灌肠，小鼠5 d后即可出现肠道炎症[9]，结肠肉眼可见黏膜充血水肿，糜烂溃疡，镜下见结肠黏膜溃疡，伪膜形成，腺管广泛消失，黏膜下组织出血，中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞浸润。7 d左右病情好转，10 d左右基本痊愈。

利用恶唑酮建立溃疡性结肠炎模型，速度较快，重复性好且制作简单，但是疾病维持时间相对较短，小鼠模型有自愈倾向，缺少慢性过程，对于慢性复发性溃疡性结肠炎的模拟度不高。

3 复合法

复合法模型的致病机制是首先破坏结肠黏膜屏障，再利用半抗原物质与肠组织蛋白结合，形成完全抗原，导致肠黏膜发生迟发型变态反应，从而造成结肠黏膜的损伤。复合法模型综合体现了溃疡性结肠炎的两个最可能的致病原因：结肠黏膜屏障的损害与免疫调节失衡，是目前较为公认的溃疡性结肠炎经典造模方法。

3.1 二硝基氯苯-乙酸复合模型 乙酸破坏结肠黏膜屏障结构，进而诱发炎症反应，二硝基氯苯作为半抗原与结肠组织蛋白结合，能够诱发T 细胞依赖性细胞介导的免疫反应，利用二硝基氯苯-乙酸溶液灌肠，可诱发大鼠的变态反应，从而建立大鼠溃疡性结肠炎模型[10]。大鼠适应性喂养一周，一周后用直径3 mm 的硅胶管经肛门插入结肠8 cm 处，注入0.04 mmol/L二硝基氯苯溶液0.25 mL，两周后，同部位注射乙酸溶液2 mL，建模完成。模型建立1～2 周，动物即可出现溃疡性结肠炎的典型表现，并可持续到十六周以上。

此模型动物存活率高，操作简单，其临床及病理表现与人溃疡性结肠炎极为相似。此模型与三硝基苯磺酸-乙醇模型的造模机制相类似，但是造模药物剂量与三硝基苯磺酸-乙醇模型相比，较难控制，故而临床采用较少。

3.2 三硝基苯磺酸-乙醇复合模型 利用以乙醇为溶剂的三硝基苯磺酸溶液对大鼠灌肠，乙醇首先破坏大鼠结肠黏膜屏障，而三硝基苯磺酸作为一种半抗原，可与大鼠体内蛋白结合，形成抗原，从而产生一系列免疫反应，继而诱发结肠炎症。将硅胶管缓慢插入大鼠结肠8 cm 处，注入三硝基苯磺酸-乙醇溶液0.5 mL/只，模型可在一周内可建立成功，三周后形成慢性溃疡性结肠炎模型，并可持续约7～8周时间。

三硝基苯磺酸与乙醇灌肠一次致炎是目前最为常用的溃疡性结肠炎模型建立方法，具有其他建模方法所没有的优点[11]。该模型所选用的三硝基苯磺酸-乙醇溶液造价较低，模型建立方法简单，模型持续时间较长，可充分体现急性炎症向慢性转化这一病情迁延过程，并且其与临床上的溃疡性结肠炎模型具有极高的相似度。

笔者对该经典方法进行了如下改良[12]：⑴利用灌胃针代替传统灌肠硅胶管，解决了灌肠液的溢出问题，增加了后续实验的可信度；⑵利用麻醉机替代传统麻醉方法，减少了外界刺激，增加的造模的稳定性，提高了造模效率；⑶确定三硝基苯磺酸溶液150 mg/kg 的380 g/L 乙醇溶液为灌肠最佳剂量，并对三硝基苯磺酸-乙醇复合模型进行了其他相关技术改良和剂量探索。经过对模型的改良，使得该模型的造模效率、造模的成功率和模型的稳定性有了显著的提高。

4 基因模型

近年来，分子生物学技术有了长足的发展，这也为溃疡性结肠炎模型的建立提供了新的思路，逐渐有学者开始建立基因型溃疡性结肠炎动物模型。基因型动物模型对于模拟溃疡性结肠炎发病机制方面具有极强的针对性，故而对于病因研究、新药研发等具有极为重要的意义。目前主要的基因型溃疡性结肠炎动物模型包括基因敲除模型和转基因模型。

4.1 基因敲除模型 基因丢失技术可以通过遗传学改变引起实验小鼠产生类似人类溃疡性结肠炎的病理变化。研究所选定的基因，多与免疫致病因素相关。目前比较成熟的基因缺陷模型所选定的基因有IL-2、IL-10、TCR基因等。IL-2作为一种细胞因子，在免疫调节中起到重要作用[13]，它的主要作用包括：⑴激活T细胞，引起T细胞的增殖分裂；⑵刺激NK细胞的生长，增强其杀伤能力；⑶促进B淋巴细胞分化及抗体产生。小鼠IL-2 基因敲除模型可在小鼠4～9 周龄时发生巨脾、自身免疫性溶血等并发症；6～15周龄时建立成功，模型小鼠病变主要发生在远端结肠，有明显溃疡形成和肠壁增厚；18周龄后小鼠有明显腹泻和便血；28周龄后小鼠逐渐死于溃疡性结肠炎。IL-2 敲除建立溃疡性结肠炎动物模型的方法已被大多数研究者所接受和采用。而IL-10 等基因敲除模型的建立，对其做了很好的补充。

利用基因敲除技术复制溃疡性结肠炎动物模型，具有自发性的特点，能很好的模拟人类溃疡性结肠炎，对于揭示病因、阐明疾病的遗传发病机制，确定易感基因，具有重要意义。但基因敲除模型的建立对于实验技术的要求较高，对于实验有一定的限制性。

4.2 转基因模型 转基因模型可通过同源重组引起的转基因过度表达可以引起小鼠溃疡性结肠炎的发生。根据目前的研究，IL-7转基因模型是目前较为成熟的溃疡性结肠炎模型，此外还有STAT-4 转基因模型、HLA-B27 转基因模型等。IL-7可影响胸腺T细胞分化增殖，对于黏膜淋巴细胞具有调节作用。IL-7 过度表达可以使黏膜淋巴细胞大量激活而导致炎症，然后IL-7 缺乏，淋巴细胞大量凋亡，溃疡性结肠炎进入慢性期[14]。

转基因模型与人类溃疡性结肠炎相似度高，为疾病的研究提供了良好的工具和载体，但是转基因模型的建立同样具有相当的技术难度。同时溃疡性结肠炎的发病具有复杂性，遗传学研究提示其可能为多基因疾病，并没有单一的基因和溃疡性结肠炎独立相关，故而转基因模型同样不能做到完全模拟人类溃疡性结肠炎和阐明其全部发病机制。

5 中医模型

中医对于溃疡性结肠炎的辩证分型共六型：⑴大肠湿热证；⑵脾虚湿蕴证；⑶寒热错杂证；⑷脾肾阳虚证；⑸阴血亏虚证；⑹肝郁脾虚证。根据中医证型所模拟出的肝郁脾虚型、脾虚型以及湿热型溃疡性结肠炎动物模型，在中医病因病机、中医辨证论治研究方面，具有其独特价值。

5.1 肝郁脾虚型模型 每天一定时间利用夹尾急性激怒、捆绑等情志刺激使大鼠之间相互撕咬、打斗，以此来改变大鼠的生理状态。处理1 次/d，每次操作时间为30 min。隔日禁食，禁食时将饲料放置在大鼠可以看到却无法触摸的地方。大鼠情绪经历稳定、易怒、倦怠的变化过程，至造模第15日，大鼠可出现反应迟缓、倦怠少动、毛发枯乱、食少便溏、体重减轻等现象，则模拟郁怒日久、木郁乘土、肝郁脾虚的病理过程成功，制造大鼠肝郁脾虚证模型[15]，三周后利用醋酸灌注大鼠结肠，模拟溃疡性结肠炎模型，从而建立大鼠肝郁脾虚型溃疡性结肠炎模型[16-17]。

该模型是目前较为理想的肝郁脾虚模型溃疡性结肠炎模型，但是由于中医症候本身极为复杂，现阶段缺乏系统合理的中医评价体系、缺乏灵敏性、特异性指标，相对于单纯西医方法所建立的溃疡性结肠炎模型，尚有研究改进的余地。

5.2 脾虚型模型 中药番泻叶苦寒泻下，用其灌服大鼠，可使大鼠产生消瘦、畏寒、懒动、精神不振等脾虚的症状[18]。灌服过程中大鼠需禁食12 h，无需禁水。1 次/d 灌服潘泻叶浸剂，3 d 后，禁食不禁水35 h，应用化学刺激法中的冰乙酸对大鼠灌肠，复制溃疡性结肠炎的病理变化，次日继续每日灌服潘泻叶2 d，至第8 d禁食不禁水，第12 d即可成功建立大鼠脾虚型溃疡性结肠炎模型[19-20]。

脾虚是溃疡性结肠炎的基本病因之一，但溃疡性结肠炎发病机制与多因素先关，如血瘀、湿热、阳虚等，脾虚型模型，从另一个角度阐述了溃疡性结肠炎的病因，与肝郁脾虚模型互为补充。

5.3 湿热型模型 采用高脂高糖饮食造成湿热体质后，利用三硝基苯磺酸-乙醇复合法灌肠，可以构建出较为理想的湿热型溃疡性结肠炎模型[21]。具体方法为：在普通饲料喂养的基础上，自由饮用浓度为200 g/L的蜂蜜水，每日上午灌服猪油10 g/kg，30 min 后灌服56°白酒10 mL/kg 白酒，共持续10 d，以造成内因湿热模型。在造模的第11 d 禁食24 h，腹腔注射麻醉后予三硝基苯磺酸100 mg/kg和50%乙醇0.25 mL混合液体灌肠，可复制成功湿热型溃疡性结肠炎大鼠模型。大鼠在湿热造模期间可出现醉酒表现、少食、体重下降及特征性黏液便。病理学可见明显充血水肿、发溃疡、炎细胞浸润等现象[22]。

脾胃虚弱是湿热发病的前提条件，以饮食不节，饥饱失常，过食肥甘的方法损伤脾胃，阻碍运化，可成功制造内湿，是经典的内因制造湿热证方法。采用高脂高糖饮食联合三硝基苯磺酸-乙醇复合法灌肠，成功制造溃疡性结肠炎湿热型模型，填补了中医溃疡性结肠炎模型分型的空白。

近年来，溃疡性结肠炎的发病率有逐渐升高的趋势[23]，并且疾病本身的发病机制并不十分明确，使得溃疡性结肠炎在治疗手段上一直停滞不前。故而在临床前研究中，选择一种稳定性强、重复性好，操作简单并且与临床症状相似度高的动物模型十分重要，这也是研究溃疡性结肠炎发病机制、研发临床新型药物的基础。现阶段溃疡性结肠炎动物模型的建立方法虽然有很多，但是也存在不少的缺陷，比如很难模拟溃疡性结肠炎的复发交替过程等。随着对于溃疡性结肠炎的研究不断深入，一些新型造模方法陆续出现，如：基因敲除、转基因等[24]。新型造模方法具有其临床相似度高等优势，但也存在技术难度大、实验成本高等缺点，但是正是因为不断涌现的新型技术，为人类研究溃疡性结肠炎，提供了希望和广阔的前景。

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