肿瘤中CCR5的表达及其临床意义

曾晓珊， 庄建良， 苏子剑

趋化因子是一类小分子的可溶性蛋白家族，具有细胞趋化性，在炎症反应中可刺激淋巴细胞的迁移活动［1］，其受体属于G蛋白偶联A类亚家族，根据其配体可分为CXC和CC两种。近年来，趋化因子及其受体的作用倍受关注，涉及多种疾病的进展，如感染性疾病、自身免疫性疾病等，其中CXCR4和CCR5可介导HIV病毒进入细胞［2］。乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等肿瘤中表达一系列的趋化因子及趋化因子受体，肿瘤来源的趋化因子及受体被认为与肿瘤的进展、转移及免疫密切相关，其中直接涉及肿瘤组织中淋巴细胞的募集，调节抗肿瘤免疫，控制肿瘤的血管生成，与肿瘤细胞的移动等相关过程。其中备受关注的有趋化因子CCL3、CCL4、CCL5及其共同受体CCR5。

1 CCR5的结构及表达

1.1 CCR5 的结构

CCR5基因位于人染色体3p21.3上，分子量为40.6 kDa，由352个氨基酸组成，具有G蛋白偶联受体所特有的7个跨膜区(7TM)，具体可分为:胞外N-末端，3个胞外环(EL1-3)，3个胞内环(IL1-3)，7个跨膜α螺旋和胞内C-末端。当其与特异的配体CCL3(MIP-1)、CCL4(MIP-1b)、CCL5(RANTES)结合后，激活G蛋白并最终引起胞内Ca2+浓度上升及蛋白激酶C的活化，趋化白细胞，调控T细胞和单核/巨噬细胞系的迁移、增殖及免疫［3］。CCR5的基因中存在多个突变体，目前已在此基因的编码区和启动子区域发现了多种有意义的突变，其中对基因编码区突变体 CCR5△32的研究最为广泛［4］。CCR5△32是指CCR5基因的32个碱基缺失导致的突变，即CCR5等位基因编码区域第185位氨基酸密码子以后发生了32个碱基缺失，致读码框架错位，缺失了与G蛋白信号通路相关的胞外第三环结构，从而使CCR5蛋白无法正常穿膜表达于细胞膜上。

1.2 CCR5在多种细胞上的表达

1.2.1 CCR5在淋巴细胞中的表达 CCR5在CD4+T细胞、NK细胞、单核细胞、未成熟的DC等多种淋巴细胞上均有表达，参与不同的免疫反应，其中在CD4+Foxp3+Terg细胞中表达倍受关注［5］。近十余年来，Treg细胞(调节性T细胞)在肿瘤免疫逃避中发挥的重要作用已被大量的研究证实及被多数学者认可［6］。Treg细胞是于1999年发现的一群具有免疫抑制功能的T细胞亚群，Treg细胞除了表达CD4分子和CD25分子外，其特征标志为其高表达的转录因子 Foxp3［7］。Liyanage 等［8］为了证明 Treg细胞上存在CCR5的表达，对外科手术切除的肿瘤标本进行CCR5及Foxp3染色，镜下观察到同时存在阳性的细胞，表明Terg细胞上存在CCR5;在外周血淋巴细胞的检测中，胰腺癌患者外周血中CD4+Foxp3+Treg细胞表达CCR5较正常人多;取肿瘤引流区淋巴结、脾脏进行CD4、Foxp3、CCR5染色，通过流式细胞方法，结果显示肿瘤组织中CD4+Foxp3+Treg细胞中(80±4)%表现为CCR5阳性，明显高于非肿瘤患者。其继续观察了CD4+T细胞、CD8+T细胞上CCR5的表达情况，发现仅少部分CD4+T细胞、CD8+T细胞CCR5表达阳性，表达率明显低于Treg细胞。虽然CCR5在 CD4+T细胞、CD8+T细胞上的表达率低，但是Loetscher等［3］发现有效的抗肿瘤免疫需要CCR5同时在CD4+T细胞及CD8+T细胞中表达，具体的机制仍不清楚，原因可能是CD4+T细胞及CD8+T细胞激活及发挥抗肿瘤作用需要CCR5的激活，导致下游的信号通路的开放。

1.2.2 CCR5在肿瘤细胞中的表达 是否所有的肿瘤细胞都表达CCR5，目前仍存在不同的观点。在乳腺癌进展及预后的相关研究中，发现乳腺癌细胞上表达功能性的CCR5［9］，后续的大量研究也陆续证明此观点。Koning等［10］使用RT-PCR方法发现人类前列腺癌细胞表达 CCR5 mRNA。Vaday等［11］运用流式细胞方法在前列腺癌细胞表面检测到CCR5的表达，同时细胞质内也发现CCR5大量存在。王栋等［12］运用免疫组化法检测乳腺癌组织中CCR5的表达情况，发现CCR5染色阳性主要位于肿瘤细胞胞质及胞膜周围。Sugasaw等［6］运用免疫组化方法，在胃癌细胞系(MKN45及KATOⅢ)中发现CCR5的表达。Kaplan等［10］在分析前列腺炎症与肿瘤中炎症因子组成及比例的不同时，应用RT-PCR方法对炎症及肿瘤组织中的CCR5扩增，结果显示CCR5在肿瘤组织中阳性率明显高于炎症组织，提示CCR5可能与肿瘤的进展及预后存在相关性。由此可见，CCR5表达于乳腺癌、前列腺癌、胃癌细胞表面，但其作用尚待进一步探究。

2 CCR5与Treg细胞

Tan等［13］已证明乳腺癌和胰腺癌患者的外周血、肿瘤引流淋巴结(TDL Ns)、肿瘤组织中，Treg细胞数量较正常人多。而CCL5/CCR5信号轴参与募集Treg细胞浸润肿瘤组织而倍受关注。他们利用基因阵列分析发现，人类胰腺癌组织中CCR5的配体CCL3、CCL4、CCL5的表达均增多，RT-PCR计量分析更证明胰腺癌组织中CCL5的表达量是正常胰腺组织的15倍。由此可见，肿瘤组织中CCL5的分泌明显增多，而Treg细胞表面表达的CCR5也较正常组织多，CCL5与CCR5相互识别，趋化Treg细胞进入肿瘤组织发挥作用。为了证明CCL5/CCR5信号轴的存在及作用，Tan等又通过打破实验鼠中CCL5/CCR5信号轴后再观察肿瘤的生长情况。他们将小鼠胰腺癌细胞系(Pan02)使用慢病毒介导的shRNA敲除技术，选出CCL5 low Pan02细胞，后将其转染Pan02小鼠，建立CCL5 low Pan02模型。观察发现CCL5 low Pan02与野生型Pan02小鼠的生长无明显差异，但CCL5 low Pan02小鼠中胰腺肿瘤的生长明显较野生型Pan02缓慢，提示CCL5分泌减少后，CCL5与CCR5结合后产生的信号减少，其介导的肿瘤免疫逃避被解除，机体的抗肿瘤免疫应答发挥作用，导致肿瘤生长延缓或受限。为进一步证明此观点，他们给予实验小鼠喂养添加了CCR5拮抗剂TAK-779(一种人工合成的、九肽CCR5拮抗剂，可选择性抑制人和鼠的CCR5)的饲料，5～7天后观察到肿瘤的生长明显慢于对照组，同时发现实验鼠的Terg(CD4+Foxp3+)细胞浸润肿瘤组织的数量较对照组减少约33%，由此说明Treg细胞浸润肿瘤组织是一种被动的行为，至少部分是由CCR5趋化的，而破坏CCR5的信号轴，可使募集到肿瘤组织的Treg细胞减少，解除Treg细胞的抗肿瘤免疫作用，肿瘤生长受影响［13］。

Liyanage等［8］运用小鼠结肠癌模型 CT26，运用RNA干扰技术敲除CCL5相关基因选出CCL 5低的肿瘤细胞(CCL 5 low CT26细胞)，CCL 5 low CT26细胞转染小鼠，建立CCL 5 low CT26小鼠模型，与野生型CT25小鼠肿瘤的生长情况比较发现，CCL 5 low小鼠肿瘤生长较野生型小鼠缓慢，同时CCL 5 low CT26小鼠的肿瘤组织中Treg细胞数量较野生型明显减少，认为肿瘤的生长缓慢可能与Treg细胞浸润减少有关;进一步对Treg细胞分泌的凋亡相关因子的比较中发现，CCL 5 low CT26小鼠中Treg细胞分泌的LAP(延迟相关肽)及TGF-b(转化生长因子b)明显减少，提示CCL5的表达不仅能募集Treg细胞，而且能促进Treg细胞分泌大量的LAP及TGF-b进入肿瘤微环境，借助于LAP或TGF-b相关信号通路介导CD8+T细胞的凋亡。

3 CCR5的抗肿瘤免疫

Uekusa等［14］发现经 IL-12处理后的小鼠肿瘤模型的脾脏内T细胞表达CCR5及其配体的mRNA增多，同时肿瘤组织中可见大量的T细胞浸润;而经CCR5拮抗剂(TAK-779)处理后的小鼠肿瘤模型中T细胞的肿瘤浸润明显受抑制，同时还发现其中涉及有 Th1、CD4+T、CD8+T 细胞。Chang等［15］也发现有少量剩余的低亲和力的肿瘤相关抗原(TAA)由特异性T细胞介导，受到刺激时可引起有效的抗肿瘤反应，而令人惊讶的是针对这些抗原的最优化的免疫反应需要CD4+T及CD8+T细胞都表达CCR5，CCR5通过CD8+T细胞发挥T细胞的抗肿瘤免疫;随后，其通过杂交技术，建立CCR5-/-小鼠模型(该小鼠不能表达CCR5)，在杂交的纯和子小鼠及野生型小鼠上种植不能表达CCR5的胸腺瘤细胞，观察两种小鼠上肿瘤的生长情况，发现CD4+T细胞上表达CCR5是CD8+T细胞表现最佳抗肿瘤反应必需的，CCR5可与TCR协同作用于经抗原刺激后的CD4+T细胞上，提高CD40L的表达水平，同时可促进APC细胞的成熟，而两者作用于随后的CD8+T细胞的活化。研究还发现CCR5可以促进TLR(Toll样受体介导)介导的抗肿瘤反应。故认为，CCR5在淋巴细胞参与的抗肿瘤免疫中发挥重要作用。

4 CCR5与肿瘤进展的相关性

目前认为，CCR5与人类肿瘤的进展相关，但其发挥的是积极还是消极作用，仍存在争议，多数观点认为，CCL5/CCR5高表达提示肿瘤预后不良。Tsukishiro等［16］认为，CCL5与乳腺癌的进展相关。Kim等［17］发现 CCL5的表达与胃癌的分期相关，CCL5表达提示预后不良。Sugasaw等［6］通过对72例CCR5表达阳性的胃癌患者的肿瘤分期比较发现，CCR5表达阳性提示预后较差。王栋等［12］对乳腺浸润性导管癌及良性乳腺肿瘤CCR5的表达情况的研究中发现，浸润性导管癌组织中CCR5的表达率明显高于良性肿瘤，认为CCR5可能在乳腺癌的生长和转移中起重要作用。Mira等［18］在研究趋化因子受体CCR5的转录在生长因子信号中的作用时发现在 CCL5的参与下，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)通过RTK信号途径可导致CCR5的转录，而CCR5的转录在IGF-1触发信号中起着开关作用，其关系到肿瘤细胞的侵袭活性。Luboshits等［19］也发现Ⅱ期、Ⅲ期乳腺癌患者CCL5的阳性表达率(83%)高于Ⅰ期(55%)，且Ⅱ期、Ⅲ期表达量亦高于Ⅰ期;而良性肿瘤及隆乳术后的患者只有15.4%的阳性表达率，提示CCL5可能与乳腺癌的进展相关，同时也暗示CCL5可能是一持续指标，可随着乳腺肿瘤的恶化不断进展。Yaal等［20］通过免疫组化方法分析乳腺癌患者不同分期、ER、PR、Her-2等肿瘤标志物与肿瘤细胞CCL5的关系，发现乳腺癌分期越晚，CCL5表达越高;研究还提示CCL5阳性可以作为Ⅱ期及以上乳腺癌的预后不良的指标，若合并 ER-，预后相对较差，而 ER+/CCL5-及 PR+/CCL5-患者预后相对较好。

CCL5/CCR5在肿瘤进展中发挥作用的具体机制目前仍不明确。Manes等［21］研究发现:(1)用CCL5刺激乳腺肿瘤细胞系，CCL5与肿瘤细胞表面的CCR5作用，并且激活 JAK2及p38-MAPK，可导致肿瘤抑癌基因p53的转录活化;(2)在小鼠乳腺恶性肿瘤模型中，抑制细胞表面CCR5的表达，可以促进表达野生型p53的乳腺癌细胞系的繁殖，而突变型p53不能;(3)基于人类的CCR5△32多态性基因的存在，此种基因型不能表达有效的CCR5，对大量乳腺癌患者的基因型及其预后比较发现，野生型p53患者中存在CCR5△32的患者的无病生存率(DFS)明显较无CCR5基因突变的患者短;相反的，p53存在突变(即不能表达有限的抑癌蛋白)的患者中，CCR5△32的患者的DFS与无CCR5基因突变的患者基本相同。推测，CCR5与p53的表达存在密切的相关性，其可能是通过调控p53的转录活性来影响乳腺癌的进程。在乳腺癌微环境中，CCL5不导致细胞的凋亡，而是依赖CCR5，限制野生型p53的表达 。Azenshtein等［9］认为，CCL5促进乳腺癌的进展可能通过乳腺癌细胞来源的CCL5趋化表达CCR5的THP-1单核细胞被募集到肿瘤组织中，单核细胞分泌 MMPs，而 MMPs如 MMP1、MMP9等参与基底膜的降解及乳腺癌的转移。Karnoub等［22］也发现间质干细胞(MSC)聚集于乳腺癌组织中，肿瘤细胞刺激MSC分泌CCL5，与乳腺癌细胞上的趋化因子受体5结合，增强肿瘤细胞的运动、浸润、转移等能力，促进乳腺癌转移。文静等［23］在研究趋化因子与乳腺癌细胞转移关系中也发现CCL5可以促进人乳腺癌细胞MCF27的侵袭，且与CCL5的浓度相关。认为可能是CCL5趋化表达CCR5的肿瘤细胞(此趋化作用可以被G蛋白抑制剂如百日咳毒素阻断)，促使其发生肌动蛋白的调节和细胞骨架的重排，迁移入血液循环中，进而转移至靶器官。

5 展望

CCR5在肿瘤中的作用越来越受到关注，其中涉及肿瘤的进展、转移及预后。更有人认为CCR5作为肿瘤预后不良的指标，应该用于临床协助判断患者的预后，甚至可用于评价肿瘤的转移潜能。对CCR5在肿瘤的发生、发展中的作用的探讨，将为肿瘤的临床治疗提供新的靶点。此外，CCR5高表达在肿瘤相关的Treg细胞上，参与Treg细胞介导的肿瘤免疫逃避，而CCR5拮抗剂可以减少肿瘤相关的Treg细胞的肿瘤浸润，能有效抑制肿瘤的生长。此种通过消耗肿瘤相关Treg细胞，而不损伤保持机体免疫稳态必需的Treg细胞的方式，可能成为肿瘤患者免疫治疗的新策略。

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