叶瓜参多糖活性成分的研究

邹峥嵘 陈贝贝 邵俊杰 焦健 易杨华

[摘要] 目的 对叶瓜参中的多糖进行分析。 方法 应用现代提取分离方法和化学及光谱鉴定技术对多糖成分进行分离鉴定。 结果 从叶瓜参中分离鉴定了CFG-1、CFG-2 和CFG-3 等3种多糖成分。 结论 CFG-1由木糖、3-甲氧基葡萄糖和葡萄糖组成，其摩尔数比=2︰1︰1；CFG-2由木糖、喹纳糖、3-甲氧基葡萄糖和葡萄糖组成，其摩尔数比=2︰1︰1︰1；CFG-3由喹纳糖和葡萄糖组成，其摩尔数比=1︰1。叶瓜参多糖CFG-2的PTP1B酶活性抑制试验显示，对PTP1B酶具有显著的抑制活性。

[关键词]海参；叶瓜参；多糖；抗糖尿病

[中图分类号] Q74???[文献标识码] B???[文章编号] 2095-0616（2012）21-91-02

Studies on the active polysaccharides from Cucumaria frondosa Gunnerus

ZOU?Zhengrong1??CHEN?Beibei1??SHAO?Junjie2??JIAO?Jian2??YI?Yanghua3

1. Jiangxi Normal University，Live Science College，Nanchang 330000，China；2. Dalian Hai Yan Tang Biology Co.，Ltd，Dalian 116021，China；3.Second Militaly Medical University，School of Pharmacy，Research Center for Marine Drugs，Shanghai 200433，China

[Abstract] Objective To analyse the polysaccharides from Cucumber frondosa Gunnerus. Methods Apply modern methods of isolation and spectrum for identification of the polysaccharides. Results 3 of polysaccharides：CFG-1，CFG-2，and CFG-3 were isolated and identified. Conclusion The CFG-1 was composed of D-xylose，3-O-methyl-D-glucose and D-glucose（mol.rate=2︰1︰1）.CFG-2 was composed of D-xylose，L-quinovose，3-O-methyl-D-glucose and D-glucose （mol.rate=2︰1︰1︰1）. CFG-3 were composed of L-quinovose and D-glucose （mol. rate=1︰1）. CFG-2 showed significant anti-diabeties activity in the PTP1B inhibition test.

[Key words] Sea Cucumber；Cucumaria frondosa Gunnerus；Polysaccharide；Anti-diabetes

海参为海洋棘皮动物，营养丰富、味美可口，具有极高的药用价值，同人参、燕窝、鱼翅齐名，是世界八大珍品之一。明代以后，海参收录于本草，作为补益药物[1]。现代研究表明，海参具有提高记忆力、延缓性腺衰老、防止动脉硬化、糖尿病以及抗肿瘤等作用[2]。叶瓜参（Cucumaria frondosa Gunnerus）属棘皮动物门（Echinodermata）、海参纲（Holothurcidea）、楯手目（Dendrochirotida）、瓜参科（Cucumariidae）的海洋动物。体长一般为50 mm，体型呈圆筒状，体色为棕色或黑色，具有较厚的体壁和坚硬的角质，触手为5个。该物种广泛分布于北极地区，俄罗斯、加拿大、挪威、英国等国海岸均有分布，此外从格陵兰到马萨诸塞的西大西洋水域也有分布[3]。多糖是海参的主要活性成分，主要有黏多糖岩和藻多糖两种[4-5]。国外学者对叶瓜参中的皂苷有过研究[6-7]，但有关叶瓜参多糖的研究鲜有报导。本课题组先期对叶瓜参中的脑苷脂进行了研究[8]。本研究对加拿大纽西兰海域的叶瓜参（C. frondosa Gunnerus）中的多糖成分进行了系统的化学分析和生物活性研究。

1?仪器与材料

1.1?实验材料

叶瓜参新鲜样品，2010年9月采自加拿大纽芬兰海域，标本保存于第二军医大学海洋药物研究中心。

1.2?仪器

GL-20G-Ⅱ冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；Alpha-1-2冷冻干燥仪，CHRIST（德国）；超滤装置，上海摩速科学器材公司；BS110分析天平，Sartorius北京赛多利斯天平有限公司；BSZ-100自动馏分收集器，上海青浦沪西仪器厂； GC/MS：Finnigan Voyager GC/MS 联用仪，配DB-5 石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）。HPLC条件：Aglient 1100 HPLC 仪，示差折光（RID）检测器。

1.3?试剂

葡聚糖凝胶，Sephadex G-25 上海仕梵化学有限公司；盐酸、硫酸、苯酚等均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司提供。

2?方法与结果

2.1?实验方法

2.1.1?叶瓜参多糖的提取分离?取叶瓜参新鲜样品，冷冻干燥，粉碎成20目冻干粉。将叶瓜参冻干粉1 000 g加入5倍量的60%乙醇冷浸并搅拌5 h。离心收集上清液，沉淀物继续按上述步骤重复提取2次，合并上清提取液，减压浓缩，得乙醇提取物。将乙醇提取物用5倍量水溶解，Sevage法去蛋白。水层溶液减压浓缩，冷冻干燥，即为叶瓜参粗多糖，称重，计算其得率为5.2%。将叶瓜参粗多糖样品溶解于25倍量的蒸馏水中，利用超滤装置，选用不同的超滤膜（截留分子量为10 KDa、5 KDa和500 Da）对叶瓜参粗多糖进行梯度超滤，得不同分子量的截留液。减压浓缩，冷冻干燥，得不同分子量范围的叶瓜参多糖。

2.1.2?叶瓜参多糖的纯化?所得到的样品再分别进行葡聚糖凝胶 Sephadex G-25柱层析，蒸馏水洗脱，硫酸—苯酚法跟踪检测洗脱液中的多糖含量，收集均一多糖组分。从分子量为10 KDa的截留液中分离得到CFG-1（得率为5.4%）、从分子量为5 KDa的截留液中分离得CFG-2（得率为6.3%）、从分子量为500 Da的截留液中分离得CFG-3（得率为6.7%）。上述叶瓜参多糖组分经HPGFC检测均单一吸收峰，经紫外扫描不含蛋白质和氨基酸。

2.1.3?叶瓜参多糖酸水解?取已纯化的叶瓜参多糖各5 mg，溶于2.5 mL三氟乙酸溶液中，置于5 mL安瓿瓶中，充氮气后进行封管。置于水浴中加热反应5 h，然后取出减压浓缩至干。加入5 mg盐酸羟胺和吡啶1.5 mL，置于90℃水浴反应30 min，冷却至室温，加入1 mL醋酐，90℃水浴反应45 min，生成糖腈乙酸酯衍生物，溶于0.5 mL氯仿溶液，进行GC-MS分析。

GC-MS分析条件：色谱柱 HP-5石英毛细管色谱柱（30 m× 0.25 mm，0.25μm） ；柱温 150℃（保持2 min）-300℃（保持10 min）汽化温度 250℃；升温速度 15℃/min；载气（流量）氦气（1.0 mL/min）；质谱检测器源温200℃、EI电离源、电离电压70 eV。

根据样品测得的吸收峰的保留时间与标准糖进行对照，确定糖的组成。根据样品测得的吸收峰的面积推测糖的摩尔数比。

2.1.4?叶瓜参多糖蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B抑制活性试验?实验材料和方法：应用大肠杆菌表达后得到蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B。实验中，以 pNPP 为底物，在96孔或384孔平底微孔板内检测酶活性。底物pNPP经PTP1B水解获得的游离产物在405 nm处有非常强的光吸收，通过酶标仪监测405 nm处光吸收强度变化，计算出样品对酶活性的抑制率（%inhibition）。

2.2?实验结果

CFG-1由木糖、3-甲氧基葡萄糖和葡萄糖组成，其摩尔数比=2︰1︰1；CFG-2由木糖、喹纳糖、3-甲氧基葡萄糖和葡萄糖组成，其摩尔数比=2︰1︰1︰1；CFG-3由喹纳糖和葡萄糖组成，其摩尔数比=1︰1。

叶瓜参多糖CFG-2的PTP1B 活性抑制试验显示，对PTP1B酶具有显著的抑制活性，在20μg/mL的浓度下，抑制率为（94.57±1.66）%，表明此多糖具有抗糖尿病的作用，可进一步将其应用于抗糖尿病药物或保健功能食品的研究开发。

[参考文献]

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[2] 方积年，丁侃.天然药物——多糖的主要生物括性及分离纯化方法[J].中国天然药物，2007，5（5）：8-12.

[3] 廖玉麟.中国动物志，棘皮动物门，海参纲[M].北京：科学出版社，1997：108-110.

[4] 方崇波.海地瓜多糖的提取和药理作用研究[J].时珍国医国药，2003，14（2）：76-77.

[5] 姜健，杨宝灵，邰阳.海参资源及其生物活性物质的研究[J].生物技术通讯，2004，15（5）：537-540.

[6] Yamadaa K，Haraa E，Miyamotoa T，et al.Isolation and structure of biologically active glycosphingolipids from the sea cucumber Cucumaria echinata[J].Eur J Org Chem，1998，2：371-378.

[7] John A Findlay，Hurettin Yayli.Noval salfated oligosaccharides from the sea cucumber cucumaria frondosa[J].J Natural Products，1992，55（1）：93-101.

[8] 喇明平，邵俊杰，焦健，等. Three cerebrosides from the sea cucumber Cucumaria frondosa[J].Chinese Journal of Natural Medicines，2012，10（2）：105-109.

（收稿日期：2012-08-07）