胃癌组织中TRβ1和β-catenin的表达及其临床意义

杨小敏，徐晓武，郭群，袁吟迅，陈艳梅，潘丹

（1.温州市人民医院 病理科，浙江 温州 325000；2.温州医科大学附属第二医院 肿瘤外科，浙江温州 325027）

胃癌的发生、发展是一个多步骤、多基因改变的过程，受多基因调控[1]。近来研究发现甲状腺激素受体β1（TRβ1）在抑制肿瘤方面起重要作用。在肝脏、乳腺[2]等部位的癌组织都发现TRβ1表达异常。目前对TRβ1、β连环蛋白（β-catenin）与胃癌各临床指标相关性的研究较少。本研究通过SP法和RT-PCR技术检测胃癌组织中TRβ1和β-catenin的表达情况，并分析两者与临床病理指标的关系，探讨其在胃癌发生、发展过程中的作用机制，为判断预后及指导临床治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 标本来源 收集2010年1月-2012年6月在我院行手术治疗的胃癌手术标本80例，其中男45例，女35例，年龄30～85岁，平均（58.3±11.6）岁。高、中分化腺癌22例，低分化腺癌58例。所有病例术前均未进行化疗或放疗。无癌胃黏膜40例，取自上述胃癌标本距癌组织10 cm以上的切缘，经石蜡切片证实无癌浸润。所有标本均经4%中性甲醛固定，石蜡包埋，连续切片厚4μm，均经病理确诊。1.2 方法

1.2.1 免疫组化主要试剂及染色：TRβ1（Clone J51；Santa Cruz）、β-catenin（Sigma）；SP 二步法染色试剂盒购自基因科技有限公司。操作步骤如下：烤片，68 ℃，30 min。4μm石蜡切片脱蜡水化，PBS洗涤3次；3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶15 min，pH 8.0的EDTA缓冲溶液高温高压抗原热修复2.5 min；PBS洗涤3次，分别滴加一抗（TRβ1）或β-catenin抗体（稀释度分别为1:50、1:200，PBS稀释），4 ℃过夜孵育。过夜孵育后室温再孵育30 min，PBS洗涤3次，滴加通用型二抗室温孵育30 min；PBS洗涤3次后DAB显微镜下控制显色，苏木素复染细胞核，水洗蓝化后乙醇脱水，中性树胶封片。

1.2.2 结果判断：根据其细胞内分布特征，分别作如下界定：TRβ1阳性染色为胞核浅棕色至深棕色，H-score法[3]依据阳性细胞的百分比和染色强度（1+，2+，或3+）的乘积之和计算总分，即H=（%1+）×1+（%2+）×2+（%3+）×3，如果切片染色评分H≤0.1（＜10% 细胞呈轻微阳性）判定为阴性，如果H＞0.1判定为阳性。β-catenin阳性染色为细胞膜或细胞浆出现棕黄色细小颗粒，参照文献[4-5]，将染色记为0～3分：细胞膜、细胞浆均未染色为0分；细胞浆染色为主为1分；异质性染色（细胞膜、细胞浆混合染色）为2分；连续的细胞膜染色为3分。细胞如果无连续的细胞膜染色被视为异常，即0～2分为阳性表达。

1.3 RT-PCR技术检测TRβ1和β-catenin mRNA表达 Trizol总RNA抽提纯化及RT-PCR试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司。TRβ1及β-catenin的引物经Gene Bank检索，利用Primer5.0软件设计，引物购自北京三博远志生物技术有限公司。TRβ1上游引物5’-TACTTAGACAAGGACGAGC-3’，下游引物5’-GTAATCCAGCACCAAATC-3’，产物305 bp；βcatenin上游引物5’-GGGCGGCACCTTCCTACTTC-3’，下游引物5’-AGCTCCCTCGCGGTTCAT-3’，产物128 bp。β-actin上游引物5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，下游引物5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，产物498 bp。退火温度分别为53、57、53.5 ℃。反应条件均为94 ℃ 预变性4 min 30 s；94 ℃变性30 s，72 ℃延伸3 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。β-actin作为内参。PCR产物于2%的琼脂糖凝胶电泳观察并应用Gel-Pro 4400凝胶分析系统进行电泳图像采集；应用Gel-Pro analyzer软件对TRβ1、β-catenin及β-actin PCR产物进行光密度值分析，根据胃癌组及无癌胃黏膜组TRβ1或β-catenin与β-actin光密度的比值标示TRβ1和β-catenin mRNA相对表达量。

1.4 统计学处理方法 采用SPSS 17.0统计软件包进行统计学分析。计量数据用±s表示，组间比较用Scheffe检验法，计数资料用x2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TRβ1蛋白的表达 无癌胃黏膜组织细胞核染色呈强阳性，偶尔胞浆也着色（见图1a）； 胃癌组织细胞核染色呈阴性或弱阳性（见图1b）。胃癌组织TRβ1的阳性表达率明显低于无癌胃黏膜组织（P＜0.01），阳性表达率分别为16.25%（13/80）、80.00%（32/40）。

图1 TRβ1蛋白在无癌胃黏膜和胃癌组织中的表达（SP法，×200）

2.2 β-catenin的异常表达 无癌胃黏膜组织βcatenin表达几乎全部定位于细胞膜上，仅有个别标本细胞浆有弱染色，未见细胞核表达，异常表达率为0（见图2a）。胃癌组织中细胞膜表达显著减少，细胞浆表达明显增加，异常表达50例，阳性率为62.50%（50/80）（见图2b），两者差异有统计学意义（P＜0.01）。

图2 β-catenin蛋白在无癌胃黏膜组织和胃癌组织中的表达（SP法，×200）

2.3 TRβ1和β-catenin mRNA的表达 TRβ1 mRNA在无癌胃黏膜组织的表达量高于胃癌组织 ，差异有统计学意义（P＜0.01）；β-catenin mRNA的表达量则呈现相反的趋势，即在胃癌组织中的表达量要高于无癌胃黏膜组织（P＜0.01）。见图3、表1。

图3 TRβ1和β-catenin mRNA表达电泳图

表1 TRβ1和β-catenin mRNA在胃癌组织和无癌胃黏膜组织中的表达（±s）

表1 TRβ1和β-catenin mRNA在胃癌组织和无癌胃黏膜组织中的表达（±s）

与胃癌组织比：aP＜0.01

组织胃癌组织无癌胃黏膜组织n 80 40 TRβ1 mRNA 0.16±0.04a 0.61±0.21a β-catenin mRNA 0.68±0.22a 0.39±0.16a

2.4 TRβ1和β-catenin mRNA表达与临床病理指标的关系 TRβ1 mRNA表达水平在细胞分化程度低、淋巴结转移、肿瘤浸润T3～T4及TNM分期III～IV期患者的肿瘤组织中较细胞分化程度较高、无远处淋巴结转移、肿瘤浸润T1～T2及TNM分期I～II期患者显著降低（P＜0.05），β-catenin mRNA则相反（P＜0.05）。而两者与患者性别、年龄及肿瘤大小均无关（P＞0.05），见表2。

3 讨论

Guigon等[6]研究表明，TRβ能与T3结合，使βcatenin和TRβ复合体之间的相互作用减弱，从而使β-catenin游离，随后β-catenin通过GSK3β调解途径或p53诱导途径降解。突变的TRβ也能与βcatenin形成复合体，但是失去了与T3结合的功能，因此即使存在T3，β-catenin也不能从复合体解离，使得β-catenin不能及时降解，从而引起细胞内βcatenin大量蓄积。β-catenin作为Wnt/β-catenin信号通路的第二信使，是Wnt信号通路的核心成分。β-catenin在细胞质内的聚积不仅是Wnt通路激活的标志，还成为恶性肿瘤中的常见事件之一[7]。在正常情况下，β-catenin在细胞膜中表达，细胞质中很少表达。若细胞质内β-catenin含量升高，会导致细胞核内含量增多，促使下游靶基因，如CyclinDl和c-myc等的持续激活，最终加强了细胞增殖活性。

表2 TRβ1和β-catenin mRNA表达与临床病理指标的关系（±s）

表2 TRβ1和β-catenin mRNA表达与临床病理指标的关系（±s）

临床病理指标性别n TRβ1P β-catenin P男 女57 23 0.15±0.037 0.17±0.052 0.6010.68±0.25 0.67±0.23 0.62 47 33 0.15±0.040 0.16±0.045 0.8080.69±0.23 0.67±0.21 0.35 22 58 0.20±0.035 0.14±0.025年龄（岁）≥60＜60分化程度高、中低肿瘤大小（cm）≤3＞3浸润深度T1～T2 T3～T4 TNM分期I～II III～IV淋巴结转移0.0060.62±0.19 0.73±0.26 0.004 38 42 0.16±0.120 0.16±0.042 0.9050.69±0.24 0.67±0.21 0.38 17 63 0.20±0.043 0.14±0.028 0.0240.65±0.21 0.71±0.25 0.012 28 52 0.19±0.036 0.13±0.022 0.0070.63±0.22 0.72±0.26 0.01无 有15 65 0.20±0.037 0.14±0.028 0.0110.63±0.23 0.73±0.28 0.006

本研究通过免疫组化SP法检测TRβ1和β-catenin蛋白在胃癌组织和无癌胃黏膜组织中的表达情况，结果发现，胃癌组织TRβ1的阳性表达率明显低于无癌胃黏膜组织（P＜0.01），阳性表达率分别为16.25%、80.00%。无癌胃黏膜组织β-catenin表达几乎全部定位于细胞膜上，仅有个别细胞浆有弱染色，未见细胞核表达，异常表达率为0。胃癌组织中细胞膜表达显著减少，细胞浆表达明显增加，异常表达率为62.50%，两者差异有统计学意义（P＜0.01）。

为了进一步证实TRβ1和β-catenin在胃癌组织和无癌胃黏膜组织中的表达情况，本研究又采用RT-PCR法对两者的mRNA含量进行检测，结果发现，TRβ1 mRNA在无癌胃黏膜组织中的表达量高于癌组织（P＜0.05），β-catenin mRNA的表达量则呈现相反的趋势，即在癌组织中的表达量要高于无癌组织（P＜0.05）。

结合以往及本研究结果，推测在胃癌的发生发展过程中有可能也发生了TRβ1突变，导致正常TRβ1 mRNA及其蛋白表达下降。突变的TRβ1使β-catenin得不到及时降解，使其在细胞内大量蓄积，导致下游靶基因的持续激活，从而引起细胞持续增殖。

有关TRβ1、β-catenin与肿瘤的临床病理特性关系的研究较少。有研究表明，两者与淋巴结转移、临床分期等有关[8-9]。本研究发现TRβ1和β-catenin mRNA的表达量与肿瘤的分化程度、有无淋巴结转移、肿瘤浸润深度及TNM 分期有关（P＜0.05），而与年龄、性别、肿瘤大小无关（P＞0.05），这可能是由于TRβ1的突变致使β-catenin在细胞膜中表达减少，从而使细胞失去黏附功能导致细胞分散，癌细胞表型改变获得高侵袭性，易于发生浸润与转移[10]。

[1] 周宏众, 韩少良, 余作黔, 等. p73和COX-2在胃腺癌中的表达及其预后意义[J]. 温州医学院学报, 2008, 38 (6): 541-543.

[2] Martínez-Iglesias O, Garcia-Silva S, Tenbaum SP, et al. Thyroid hormone receptorβ1 acts as a potent suppressor of tumor invasiveness and metastasis[J]. Cancer Res, 2009,69(2): 501-509.

[3] McCarty KS Jr, Szabo E, Flower JL, et al. Use of a monoclonal anti-estrogen receptor antibody in the immunohistochemical evaluation of human tumors[J]. Cancer Res,1986, 46(8 Suppl): 4244s-4248s.

[4] Jawhari A, Jordan S, Poole S, et al. Abnormal immunoreactivity of the E-cadherin-catenin complex in gastric carcinoma: relationship with patient survival[J]. Grastroenterology, 1997, 112(1): 46-54.

[5]王渝, 柯昌庶, 赵秋, 等. E-cadherin,β-catenin, CyclinD1在胃腺癌中的表达及临床意义[J]. 世界华人消化杂志, 2007, 15(4): 403-407.

[6] Guigon CJ, Zhao L, Lu C, et a1. Regulation ofβ-catenin by a novel nongenomic action of thyroid hormoneβ receptor[J]. Mol Cell Biol, 2008, 28(14): 4598- 4608.

[7] 云波, 刘淑萍, 王海生, 等. Wnt通路中β-catenin在恶性肿瘤中的异常表达[J]. 科学技术与工程, 2010, 10(20): 5027-5030.

[8] 彭旭升, 石怀银. 甲状腺激素受体β1 在甲状腺滤泡癌的预后价值[J]. 军医进修学院学报, 2012, 33(6): 602-603, 606.

[9] 俞敏, 冯一中, 高璀乡. 胃腺癌中PAR-2,β-catenin和COX-2的表达及其意义[J]. 临床与实验病理学杂志, 2011, 27(6): 590-593.

[10]Hrkk TT, Tuppurainen K, George SM et al. Thyroid hormone receptorβ1 in normal colon and colorectal cancerassociation with differentiation, polypoid growth type and K-ras mutations[J]. Int J Cancer, 2006, 118(7): 1653-1659.