小鼠胸膜纤维化模型中CX43蛋白的动态表达

向叶宸 杨 洁 穆 庆 陈利军 蔡鹏程 叶 红 马万里

（华中科技大学同济医学院附属协和医院呼吸内科，1附属协和医院临床检验科，武汉430022；2基础医学院病理生理学系；卫生部呼吸系疾病重点实验室，武汉430030）

间隙连接是细胞间直接进行信息交流的唯一膜通道结构。CX43是间隙连接中分布最广、研究最多的间隙连接分子。CX43与众多的蛋白发生相互作用，从而在间隙连接蛋白的组装、运输、膜定位、间隙连接通道的形成以及对间隙连接通讯的调控等一系列过程中发挥十分重要的作用。CX43在肺内各种细胞中广泛表达，在I型和II型上皮细胞的连接中发挥重要作用。研究发现，肺血管内皮表达的CX43在炎症细胞粘附到内皮细胞的过程中起关键作用，说明其具有促炎作用［1］。在急性肺损伤时CX43蛋白是上调的［2，3］，但特发性肺纤维化病人肺成纤维细胞晚期肺纤维化阶段CX43表达是下调的［4］。促纤维化因子TGF－β1可上调CX43和下调CX37而引起纤维化［5］。最近的报道提示CX43通过间隙连接通道的形成而增加细胞对毒性物质的敏感性［6］。

肿瘤化疗药物博莱霉素可导致肺纤维化及胸膜纤维化，其发病机制与早期的炎症浸润和晚期的细胞外基质沉积有关。在早期炎症阶段，T淋巴细胞、肺泡巨噬细胞、B淋巴细胞以及骨髓来源的纤维细胞迁移、浸润入肺泡间质，从而释放炎症因子及促纤维化因子如TGF－β等。炎症细胞是否能够游离到肺间质中则与血管内皮细胞间隙连接的功能状态有关，其中间隙连接蛋白对间隙连接功能调节起主要作用。

博莱霉素可诱导肺纤维化，但是在动物胸腔内单纯注射博莱霉素难以观察到典型的胸膜纤维化，本文使用博莱霉素加碳粉复制小鼠胸膜纤维化模型，检测CX43在不同时间点的动态表达，以研究CX43的表达变化与胸膜纤维化发展进程的关系。

材料和方法

1.模型复制

小鼠胸膜纤维化模型的复制采用Decologne等的方法［7］。将成年C57BL／6J小鼠（购自武汉大学医学院动物中心，雌性，体重15±2g）随机分为三个实验组（F2、F7、F21）和三个对照组（C2、C7、C21），每组5只。实验组每只小鼠经肋间隙一次性胸膜腔给予0.2ml含0.07μg博莱霉素（bleomycin）和1 mg碳粉（carbon）的生理盐水，对照组给予0.2ml生理盐水，分别于第2d（F2组和C2组）、第7d（F7组和C7组）和第21d（F21组和C21组）处死动物，取出肺及胸膜组织，10%中性甲醛溶液固定。

2.Masson染色检测胶原纤维含量

固定的肺及胸膜组织常规脱水，石蜡包埋，切片，常规Masson三联染色检测胶原纤维的含量。

3.免疫组化染色检测CX43蛋白的表达

取石蜡切片，60℃烤2 h，二甲苯脱蜡，酒精梯度入水，PBS 洗3 min×3 次；0.3%Triton X－100室温孵育20 min；3%H2O2室温孵育15 min，以灭活内源性过氧化物酶；10%山羊血清 封闭，室温30 min；甩去多余液体，不洗；加入1∶100稀释的羊抗鼠CX43亲和纯化多克隆抗体，4℃过夜，0.01 mol／L PBS洗5 min×3次；滴加生物素化兔抗羊IgG，37℃45 min。0.01 mol／L PBS洗5 min×3次；滴加SABC 试剂，37℃20 min；0.01 mol／L PBS 洗5 min×4次；DAB显色，蒸馏水洗涤；苏木素轻度复染，脱水、透明、封片；显微图像分析。

4.图像分析及统计处理

免疫组化在400倍视野下，每张玻片随机取5个肺边缘靠近胸膜的视野，用Image Pro－Plus显微图像分析系统分别测定阳性颗粒的平均吸光度值（A值），进行分析处理。数据用mean±SD表示，采用均数比较的t检验，P＜0.05有统计学差异。

结 果

1.Masson染色显示博莱霉素和碳粉引起各组小鼠胸膜胶原沉积

Masson染色结果显示，博莱霉素和碳粉处理的小鼠中，第2d胸膜即明显增厚，有大量炎症细胞浸润并有胶原纤维沉积；第7d胸膜增厚达到高峰，胶原明显增多；第21d胶原含量进一步增多，但胸膜厚度较前减少。提示博莱霉素加碳粉确实引起了胸膜纤维化，早期表现为胸膜炎，晚期表现为胸膜纤维化（见图1）。

2.免疫组化染色显示的胸膜组织CX43蛋白的动态表达

CX43免疫组化染色结果显示，博莱霉素和碳粉刺激的小鼠中，随着病程进展，胸膜纤维化小鼠胸膜间皮细胞CX43表达呈现先逐渐增加后递减的趋势，并且末期胸膜间皮细胞CX43表达量低于早期。如图2所示，胸膜组织CX43的表达的光密度值各实验组始终高于其各自对照组，且有显著性差异（P＜0.05）。在实验组中，第2d组小鼠的胸膜CX43表达的光密度值略低于第7d组小鼠，但无显著性差异（P＞0.05）。而第7d组小鼠的胸膜CX43表达的光密度值略高于第21d组小鼠，有显著性差异（P＜0.05）。提示博莱霉素和碳粉的刺激可导致CX43蛋白表达增加，第7dCX43表达增加程度最大（见图2）。

图1 博莱霉素和碳粉引起的小鼠胸膜胶原沉积（Masson三联染色，蓝色为胶原纤维，标尺＝100μm）图2 博莱霉素和碳粉引起小鼠胸膜组织CX43动态表达（免疫组化染色，棕色为阳性颗粒，＊与对照比较，＃与第7d博莱霉素和碳粉组比较）Fig.1 Bleomycin and carbon particles induced pleural collagen deposition in C57BL／6J mice.（Masson staining，bar＝100μm）Fig.2 Bleomycin and carbon particles induced dynamic up－regulation of pleural CX43 protein expression.（Immunohistochemistry staining，bar＝100μm.＊compared with control，＃compared with bleomycin＋carbon of 7th day）.

讨 论

博莱霉素常用于复制肺纤维化模型，但是在动物胸腔内单纯注射博莱霉素难以观察到典型的胸膜纤维化，本研究根据文献报道采用博莱霉素加碳粉复制胸膜纤维化模型［7］，胸膜组织经历了从早期的急性胸膜炎到晚期的纤维化阶段，胶原纤维含量逐渐增加，胸膜壁明显增厚，说明胸膜纤维化模型复制成功。

间隙连接参与炎症反应的多个过程，包括抗原提呈、趋化因子和细胞因子的产生、炎症细胞的迁移、粘附和活化。CX43是广泛表达的构成间隙连接中的间隙连接分子，有研究表明，CX43在炎症反应中起着重要作用，随着炎症的产生组织中CX43的表达增加，急性肺损伤可导致其上调［1－3］。在星形胶质细胞，IL－1β和 TNF－α的混合物可活化CX43通道，而阻断其活性可减轻神经损伤［8］。CX43通过半通道的形成而改变细胞的氧化状态从而增加细胞对镉的细胞毒性的敏感性［6］。在肺组织，LPS可诱导CX43的表达上调，进而引起中性粒细胞向气道的募集，抑制CX43可抑制炎症的程度［9］。用CX43的反义寡核苷酸阻断CX43的作用可减轻炎症反应［10，11］。放射线照射可导致肺泡上皮细胞CX43蛋白表达增加，其磷酸化亦增加［3］。但CX43在胸膜炎时的表达变化及其与胸膜纤维化形成的关系目前未见报道。

为研究CX43在胸膜纤维化发病进程中的作用，我们检测了CX43蛋白的原位表达，发现CX43蛋白的表达与炎症程度明显相关，在第2d即有明显上调，第7d达高峰，21d稍有所降低，但仍高于对照组。纤维化的早期伴随的是胸膜炎症的发生，因此胸膜间皮细胞CX43表达先增加可能与炎症反应关系密切，炎症越严重CX43的表达越高。模型早期由于炎症反应强，导致胸膜间皮细胞表达大量的CX43，而随着炎症的消退和胸膜纤维化的产生导致胸膜间皮细胞CX43的表达量逐渐减少，晚期由于纤维化的形成，CX43的表达进一步降低，但仍高于对照组。提示CX43参与博莱霉素和碳粉引起的胸膜纤维化的发病进程，而且在早期炎症阶段作用更明显。

炎症导致CX43上调的机制目前尚不清楚，有报道提示细胞因子IL－1β、TNF－α以及LPS通过上调iNOS进而使NO产生增多而导致CX43表达增加［12－14］。CX43在纤维化的发病机制中的作用尚存在不同的意见，CX43－／－／CX40－／－的老年小鼠出现明显的肺功能异常，表现为纤维化的增加，异常的肺泡重建以及肺内成纤维细胞的增多，并有心肌肥大和高血压［15］，提示CX43与纤维化的关系与年龄等因素密切相关。

综上所述，在博莱霉素加碳粉引起的小鼠胸膜纤维化模型胸膜组织CX43蛋白表达增加，尤其在早期炎症阶段CX43表达增加更为明显，CX43是通过促进胸膜炎症而在胸膜纤维化的发病中发挥重要作用。

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