橡实淀粉发酵生产酒精专用酵母菌株的筛选

李安平，谢碧霞，沈 伟，蒋雅茜

橡实淀粉发酵生产酒精专用酵母菌株的筛选

李安平1,2，谢碧霞1，沈 伟1，蒋雅茜1

（1.中南林业科技大学，湖南 长沙 410004；2.稻谷及副产物深加工国家工程实验室，湖南 长沙 410004）

从栓皮栎自然发酵基质中分离得到的36株酵母菌，经TTC 平板显色图变化挑选出5株菌株，分别测试比较其发酵性能。结果表明：筛选的5株酵母菌菌落形态基本一致，但酵母菌XS03和XS04的死亡率显著低于XS01、XS02和XS05等3株酵母菌（P＜0.05）的死亡率；在酒精浓度低于6%时，酵母菌XS03和XS04比酵母菌XS01、XS02和XS05等具有更高的耐酒精能力和耐高塘能力；发酵36 h后酵母XS03和XS04的失重率和出酒率显著高于XS01、XS02和XS05等3种菌种（P＜0.05）。

橡实淀粉；发酵；酵母菌株；筛选

能源是国家重要的战略性资源，但化石能源存在一定的污染性和有限性，因此，人们逐渐将注意力转移到可再生和低污染的燃料酒精能源方面[1]。但以粮食为原料的高生产成本又阻碍了燃料酒精的发展[2]。燃料酒精主要采用发酵法生产，而酵母菌株是影响发酵法中淀粉出酒率和酒精发酵质量的关键因素之一[3]。不同的发酵原料需要不同酒精耐受性的高产酵母菌株。筛选性能优异的酵母，不仅可以提高酒精发酵质量和淀粉出酒率，而且能降低原料消耗及生产成本[4]。

橡实 acorn，又称为橡子，是壳斗科Fagaceae植物果实的通称，分布区域极广[5]。我国约有橡实300余种，估计橡实年产量有60～70亿kg，然而大部分橡实并没有得到利用[6]。橡实种仁中淀粉含量约为50%～70%，是良好的淀粉质原料[7]，因此，以橡实为原料发酵生产燃料酒精是较好的利用途径。在众多橡实品种中，栓皮栎产量较高，且具有典型橡实品种特征，因此选择以栓皮栎为例进行研究。本研究从栓皮栎自然发酵基质中分离出一些具有较高酒精耐受性能的酵母菌,并对该菌株的发酵性能进行初步研究，期望能为燃料酒精的工业化生产提供帮助。

1 材料与方法

1.1 原材料

栓皮栎Quercus variabilis Blume，采自湖南南岳衡山。

1.2 设备与仪器

SHP-150型生化培养箱、DL-6M/DL-6MI大容量冷冻离心机、岛津UV1700 分光光度计。

1.2.1 培养基[8]

富集培养基：葡萄糖5.0 g，酵母膏0.05 g，KH2PO40.25 g，尿素 0.1 g，，MgSO4·7H2O 0.1 g，Fe2(SO4)30.01 g，孟加拉红（1%的水溶液），加蒸馏水至100 mL，用H2SO4调节pH至4.5，115℃温度下高压灭菌15 min。

分离纯化培养基：葡萄糖5.0 g，酵母浸膏0.8 g，蛋白胨1.0 g，琼脂1.5 g，用蒸馏水定容至100 mL，培养基pH值用H2SO4调节至4.5，115 ℃温度下灭菌15 min，冷却后倒平板备用。

发酵培养基:葡萄糖15.0 g，酵母浸膏0.5 g，NH4Cl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.06 g，蛋白胨 0.5 g，KH2PO40.1 g, 用蒸馏水定容至100 mL，培养基pH值用H2SO4调节至4.5，115 ℃温度下灭菌15 min。

1.2.2 菌种的培养分离[9]

将新鲜栓皮栎样品粉碎后置于发酵瓶中让其自然发酵。待栓皮栎发酵基质在发酵瓶中有大量气泡产生时，取发酵醪液10 mL置于100 mL 酵母富集培养基中，28 ℃培养约20～24 h，然后取发酵液梯度稀释，平板涂布，每一梯度做3个平行，28 ℃培养箱中培养48 h。将具有典型酵母菌落形态的菌落用竹签在麦芽汁培养基平板上划线分离，直至单菌落出现，然后镜检，挑选纯单菌落，接种于麦芽汁试管斜面上，28 ℃培养12 h后，于4℃冰箱中冷藏备用。

1.3 酵母菌种的筛选[10]

初筛选：由菌落的颜色可初步判定酵母产酒精的能力，因此挑选具有红色特征的菌落作为初筛选的标准。

复筛选：将初筛选出的菌株经活化后接入酒精浓度分别为0%、3%、6%、9%(V/V)的富集培养基中，于温度为28 ℃的摇床上培养，每间隔2 h测定1次培养基的吸光度OD560，然后绘制酵母的生长曲线。通过比较酵母菌在不同酒精浓度下的生长情况筛选具有较好酒精耐受性的菌株。

1.4 酵母发酵性能测试[11]

将筛选酵母置于发酵培养基中进行常规发酵性能测试。在酵母的发酵周期内定时取样测定发酵醪液中的pH 值、糖度、吸光度OD560和酒精度。初始酒精浓度用无水乙醇调节，初始糖度用固体葡萄糖调节。

1.5 酒精浓度的测定[12]

取100 mL发酵醪液置于500 mL的蒸馏瓶内，加蒸馏水100 mL，然后加热蒸馏，直至馏出100 mL溶液，用酒精比重计测定其酒精度，同时测定此时的温度，将测得的酒精度换算为20 ℃时的酒精浓度。

1.6 各酵母菌株的橡实淀粉出酒率比较实验[13-15]

用带发酵栓的500 mL磨口三角瓶装入溶解了60 g栓皮栎淀粉的300 mL发酵溶液，然后在温度28 ℃、起始pH为4.5的条件下接入不同酵母菌株发酵。观察5株酵母菌株在带发酵栓的磨口三角瓶中发酵情况，分别测定12 h、24 h、36 h、48 h和60 h 的CO2失重率（失重率=某时刻CO2失重量/溶液总重量），并测定成熟发酵醪的淀粉出酒率[原料出酒率（%）=酒精产量（mL）×95%/原料耗用量（g）]。

2 结果与讨论

2.1 分离和纯化所得酵母菌的形态特征比较

通过富集培养、分离、鉴定和纯化等的比较筛选，从橡实发酵基质中分离得到36株具有典型酵母菌菌落特征的菌株，结合0.1%的TTC 平板显色图变化挑选出5株菌株，分别编号为XS1-5。经2～3次活化，接种于橡实淀粉基质中培养24 h，观测菌落形态、大小、出芽率和死亡率。结果见表1。

表1 酵母菌的形态特征比较Table 1 Comparison of morphological characteristics of yeasts

从培养状况的观测表明，筛选的5株酵母菌菌落形态基本一致，为圆形，低凸起，边缘整齐，不透明，表面光滑，闪光，乳白色，蜡状。酵母菌个体普遍较大且均匀，基本尺寸在5.0～8.2×5.0～10.0 μm之间，其死亡率较低，出芽率较高。5株酵母菌相比较，XS03、XS04的死亡率显著低于XS01、XS02和XS05等3菌株（P＜0.05）。

2.2 各酵母菌株耐酒精能力比较

将经初筛选获得的5株长势较好的酵母菌接入发酵培养基中发酵，比较它们在酒精浓度(V/V)分别为0%、3%、6%、9%条件下的生长情况。结果见图1～图4。

图1 0%酒精浓度下酵母菌的生长曲线Fig.1 Growth curves of yeasts with 0% alcohol concentration

图2 3%酒精浓度下酵母菌的生长曲线Fig.2 Growth curves of yeasts with 3% alcohol concentration

图3 6%酒精浓度下酵母菌的生长曲线Fig.3 Growth curves of yeasts with 6% alcohol concentration

图4 9%酒精浓度下酵母菌的生长曲线Fig.4 Growth curves of yeasts with 9% alcohol concentration

从图中可以看出，在初始发酵液中酒精浓度(V/V)为0的情况下，发酵时间不超过72 h时，5种发酵酵母的生长情况基本一致；当超过72 h时，酵母XS03和XS04的生长明显快于其它3种酵母，此时酵母XS01、XS02和XS05的生长几乎完全停滞。当初始发酵液酒精浓度为3%和6%时，发酵时间不超过48 h，5株菌株的生长基本一致，但超过48 h后，XS3和XS4有着较强的酒精耐受性，其生长显著快于其它3种菌株。当初始发酵液酒精浓度为9%，5种菌株从发酵开始即受到了抑制，生长均非常缓慢。5种酵母菌株的酒精耐受能力比较表明，XS3和XS4比其它3种菌株具有更强的耐受酒精能力。

2.3 各酵母菌株耐高糖能力比较

将5种筛选的酵母菌接入初始糖度分别为5 Brix、10 Brix、20 Brix、30 Brix、40 Brix、50 Brix、60 Brix的培养基中发酵培养。在温度为28 ℃、起始pH为4.5的条件下发酵24 h后，分别测定各菌种发酵醪液在560 nm时的吸光度值。结果见图5。

图5 初始糖浓度对酵母菌生长的影响Fig.5 Yeasts’ tolerance to different sugar concentrations

从图5 可以看出，当初始糖度为20 Brix时，经过一段时间的发酵培养，5种酵母菌株发酵液的吸光度均达到最大值。随着糖度的增大和减小，各菌株的吸光度均减小。说明以橡实为淀粉质发酵，初始糖度浓度在20 Brix左右较适合这5种酵母菌株的生长。当糖度升高到60 Brix 时，酵母生长趋于停顿。5种酵母菌株发酵比较表明，XS03和XS04发酵速度明显快于XS01、XS02和XS05等3种菌株。XS03和XS04的生长曲线一直位于其它3种菌株生长曲线的上方，说明该菌株对高糖的耐受能力更强。

初始发酵糖浓度对酵母菌生长存在一定的影响，如果糖浓度过低会使酵母菌因营养不足而导致生长缓慢；如果糖浓度过高又会因渗透压增大而抑制酵母菌的生长繁殖。因此，选择20 Brix左右的糖度对以橡实为原料的酵母菌是较合适的。

2.4 各酵母菌株的淀粉出酒率比较

酵母菌株在发酵过程中，利用淀粉质原料不断产生酒精，释放出CO2，其重量随之减少。不同酵母菌株的代谢能力有差异，对淀粉质原料的利用程度不同，导致最终淀粉的出酒率也存在差别。各酵母菌株的各时段的CO2失重率及出酒率见表2。

表2 发酵醪液的CO2失重率及出酒率比较Table 2 Comparison of weight loss rate of CO2 and conversion rate of alcohol among fermented mashes

由表2可知，发酵24 h后各菌株间的失重率没有显著性差异（P＞0.05），但发酵36 h后各种酵母继续产生CO2，重量不断减轻，各酵母间的失重率存在显著性差异（P＜0.05），XS03和XS04的失重率显著高于XS01、XS02和XS05等3种菌种。此后各菌株仍在不断发酵产生CO2，在48 h和60 h时测定的各菌株间发酵状况和36 h的发酵状况是一样的，但48 h和60 h间的失重率变化较少，说明发酵到48 h时基本结束。对以栓皮栎淀粉为原料的生产燃料酒精，5种菌株在淀粉出酒率方面有显著性差异，XS03和XS04两菌株的出酒率比XS01、XS02和XS05等3菌株要高。

3 小 结

橡实是一种资源丰富，淀粉含量高，但尚未得到有效开发利用的资源，以橡实淀粉为原料开发燃料酒精具有现实可行性。研究表明，从栓皮栎自然发酵基质中分离得到的5株优良酵母菌性能测试显示，筛选的5株酵母菌菌落形态基本一致，但酵母菌XS03和XS04的死亡率显著低于XS01、XS02和XS05等3株酵母菌（P＜0.05）。在酒精浓度低于6%时发酵，XS03和XS04比XS01、XS02和XS05等具有更强的生命活力和耐高塘能力，发酵36 h后酵母XS03和XS04的失重率和出酒率显著高于XS01、XS02和XS05等3种酵母菌（P＜0.05）。因此，酵母XS03和XS04是较适合栓皮栎淀粉发酵生产燃料酒精的菌株。

[1] Renyong Zhao, Scott Bean, Xiaorong Wu, et al. Assessing Fermentation Quality of Grain Sorghum for Fuel Ethanol Production Using Rapid Visco-Analyzer[J]. Cereal Chemistry,2008, 85(6): 830-836.

[2] 李安平,谢碧霞,田玉峰,等.橡实淀粉生料发酵生产燃料酒精工艺研究[J].中国粮油学报,2011,26(3):91-94.

[3] 赵祥杰,杨荣玲,肖更生,等.桑椹果酒专用酵母的筛选及鉴定[J].中国食品学报,2008,8(1):60-66.

[4] 双 宝,李 明,李 慧,等.一株酒精酵母的分离及其发酵性能分析[J].东北农业大学学报,2011,42(6):130-134.

[5] 谢碧霞,谢 涛.我国橡实资源的开发利用[J].中南林学院学报,2002,22(3):37-41.

[6] 胡芳名,李建安.湖南省主要橡子资源综合开发利用的研究[J].中南林学院学报,2000,20(4):41-45.

[7] 谢碧霞,陈 训.中国木本淀粉植物[M].北京:科学出版社,2008,5.

[8] 赵祥杰,肖更生,杨荣玲,等. 桑椹果酒酵母筛选及发酵性能[J].食品与生物技术学报,2007,26(1):95-99.

[9] 张慧敏,姚善泾,彭立凤,等.在不同碳源培养条件下酿酒酵母的蛋白质组解析[J].生物工程学报,2004,20(3):398-402.

[10] Bai F W, Anderson W A, Moo-Young M. Ethanol fermentation technologies from sugar and starch feedstocks[J]. Biotechnology Advances, 2008, (26): 89-105.

[11] Atsushi KOTAKA, Hiroshi SAHARA, Yoji HATA, et al.Efficient and Direct Fermentation of Starch to Ethanol by Sake Yeast Strains Displaying Fungal Glucoamylases[J]. Biosci.Biotechnol. Biochem., 2008, 72 (5): 1376-1379.

[12] 田玉峰,李安平,谢碧霞,等.橡实淀粉生物乙醇化橡实品种和菌种的筛选[J].食品科学,2011,32(7):207-210.

[13] Lee Hyang Aeea, Kim Nam Hiea, Katsuyoshi Nishinarib,et al. DSC and rheological studies of the effects of sucrose on the gelatinization and retrogradation of acorn starch[J].Thermochimica Acta, 1998, (322): 39-46.

[14] 聂世现,王 钰,黄文静,等. 高产酒精酵母菌株及甘薯品种筛选[J].食品工业科技,2011,32(2):159-162.

[15] 田玉峰, 李安平, 谢碧霞,等.橡实淀粉可食用性技术的研究[J].中南林业科技大学学报,2010,30(7):94-99.

Screening of special yeast for ethanol production by acorn starch fermentation

LI An-ping1,2, XIE Bi-xia1, SHEN Wei1, JIANG Ya-qian1
(1. Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2.National Engineering Lab. for Rice and Byproducts Processing, Changsha 410004, Hunan, China)

36 yeast strains has been isolated from cork oak natural fermentation matrix, of them, five strains were selected by using the TTC plate change color chart, their’s fermentation performance were tested and compared each other. The results show that the colony morphology of the five yeast colonies were basically identical, but the yeast XS03 and XS04 mortality rate were significantly lower than the XS01, XS02 and XS05 other three yeast strains (P ＜0.05) mortality; under the condition of alcohol concentrations less than 6%, yeast XS03 and XS04 had higher alcohol tolerance and higher Gaotang resistance capacity than XS01, XS02 and XS05, etc. the weight loss rate and the yield of liquor of yeast XS03 and XS04 after being fermenting 36 hours, were significantly higher than that of XS01, XS02 and XS05 (P ＜0.05).

acorn starch; fermentation; yeast strain; screening

S789

A

1673-923X(2012)08-0098-05

2011-11-07

林业公益性行业科研专项“野生木本淀粉种质资源评价与精加工技术研究”（200804033）；湖南省科技计划项目“橡实淀粉生物乙醇关键技术研究”（2010NK3040）

李安平（1967—），男，湖南永州人，教授，博士，主要从事林副产品深加工研究；E-mail：lianpinglianping@yahoo.com.cn

[本文编校：文凤鸣]