正交试验优选薄荷总黄酮超声提取工艺研究

喻林华，方 晰，田春燕，苏恒枫

正交试验优选薄荷总黄酮超声提取工艺研究

喻林华，方 晰，田春燕，苏恒枫

（中南林业科技大学 生命科学与技术学院，湖南 长沙410004）

优选薄荷总黄酮的最佳提取工艺。以芦丁为标准品，以薄荷为原料，采用分光光度法测定总黄酮含量，以乙醇浓度（A）、液料比（B）、超声提取时间（C）和水浴温度（D）为考察因素，通过单因素试验和正交试验优选提取工艺。结果影响薄荷总黄酮提取效果的主次因素为：B＞C＞D＞A，优选出薄荷总黄酮最佳提取工艺为B2C2D1A1，即液料比为30∶1，超声波提取时间40 min，水浴温度50℃，提取液乙醇的浓度为40%。在该工艺条件下，薄荷总黄酮得率为9.89%。采用超声波提取工艺方法简单、安全、快速。

薄荷；正交试验；总黄酮；超声提取

薄荷Mentha haplocalyx Brip.又称苏薄荷、水薄荷、鱼香草、人丹草等，是常见的中药材料，重要的天然香料。薄荷作为中药, 味辛散，性凉。有疏散风热、清利咽喉、透疹的功能；用于感冒风热、头痛、目赤、咽喉红肿疾痛、皮肤瘙痒、疹透发不畅[1]。现代研究发现，薄荷含挥发油、黄酮、有机酸、氨基酸等化学成分，对中枢、消化、呼吸等系统的药理作用明显，薄荷提取物中含有黄酮类、酚类等强有力的自由基清除剂，具有抗氧化作用[2]，故薄荷被广泛应用于医药、食品、化妆品等行业。超声波提取技术在提取薄荷中黄酮类物质的研究中报道不多，为此，本实验采用超声波乙醇提取法提取薄荷中的总黄酮，并优选薄荷总黄酮最佳提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

新鲜薄荷叶（采集于中南林业科技大学校园内）；NaNO2，NaOH，无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；芦丁标准品（98%，长沙市迈科为生物科技有限公司）。

1.2 主要仪器设备

FZ102型微型植物粉粹机、恒温水浴锅、恒温干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；SB-5200D 超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；722S可见光分光光度计（上海菁华科技有限公司）；电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）等。

1.3 实验方法

1.3.1 芦丁标准曲线的制作[3]

将芦丁标准品干燥至恒温，用电子天平准确称取0.005 0 g，用浓度30%的乙醇溶解于25 mL的容量瓶中，制成浓度为0.2 mg/mL的芦丁标准品溶液。分别准确吸取芦丁标准品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分别置于10 mL容量瓶中，再依次加入2 mL浓度30%乙醇溶液、0.3 mL浓度5%NaNO2溶液，摇匀，静置6 min后加入2 mL浓度4%NaOH溶液，摇匀，用30%乙醇溶液定容至刻度线，静置15 min，以30%乙醇溶液为空白，于波长510 nm处测定吸光度值A。

1.3.2 薄荷总黄酮的提取方法

将新鲜薄荷叶洗净晾干后，置于温度为60℃的恒温干燥箱中干燥15小时，中间不定时地翻动叶子，使其干燥至恒重。用微型植物粉粹机尽快将干燥好的薄荷叶粉碎成粉末，密封，置于阴凉干燥处备用。

准确称取薄荷叶粉末1.000 0 g于250 mL的锥形瓶中，加入一定浓度的乙醇溶液，封口，并在一定温度水浴一段时间，然后超声提取一定时间，冷却后，过滤，定容至250 mL，摇匀，取2 mL置于10 mL容量瓶中，按步骤1.3.1中标准溶液配制相同的方法，测定吸光度。根据标准曲线，按下式计算样品中总黄酮的含量：

总黄酮含量（mg）=（C×10）/2×250

总黄酮得率=（总黄酮含量/干薄荷叶粉末质量）×100%

(C：标准曲线计算得到的总黄酮浓度（mg/mL）；10：测试液定容体积（mL）；250：待测液总体积（mL）；2：测试液体积（mL）。)

乙醇浓度、液料比、提取时间、水浴温度为薄荷叶总黄酮提取率的主要影响因素，在单因素试验的基础上，对影响提取效果的主要因素进行正交试验。

1.3.3 单因素试验方法

1.3.3.1 乙醇浓度对总黄酮得率的影响

准确称取5份质量为1.000 0 g的薄荷叶粉，加入30 mL浓度分别为30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，在60℃温度下水浴1 h，超声提取30 min，冷却过滤，将滤液定容至250 mL，在波长510 nm处测定吸光度值A，研究不同乙醇浓度对薄荷叶总黄酮提取率的影响。

1.3.3.2 液料比对总黄酮得率的影响

准确称取5份质量为1.000 0 g的薄荷叶粉，分别加入30%乙醇溶液10 mL、 20 mL、30 mL、40 mL、50 mL，此时液料比（体积质量比mL/g）为 10∶1、20∶1、30∶1、40∶ 1、50∶ 1，在60℃温度下水浴1 h，超声提取30 min，冷却过滤，将滤液定容至250 mL，在波长510 nm处测定吸光度值A，研究不同液料比对薄荷叶总黄酮提取率的影响。

1.3.3.3 超声波提取时间对总黄酮得率的影响

准确称取5份质量为1.000 0 g的薄荷叶粉，分别加入30 mL浓度为30%的乙醇溶液，在60℃温度下水浴1 h，分别超声提取20、30、40、50、60 min后，冷却过滤，将滤液定容至250 mL，在波长510 nm处测定吸光度值A，研究不同超声波提取时间对薄荷叶总黄酮提取率的影响。

1.3.3.4 水浴温度对总黄酮得率的影响

准确称取5份质量为1.000 0 g的薄荷叶粉，加入30 mL浓度为30%的乙醇溶液，分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的温度下水浴1 h，超声提取30 min，冷却过滤，将滤液定容至250 mL，在波长510 nm处测定吸光度值A，研究不同水浴温度对薄荷叶总黄酮提取率的影响。

1.3.4 正交试验方法

在单因素试验基础上，薄荷叶以乙醇浓度A、液料比B、超声提取时间C、水浴温度D为4个考察因素，每个因素选择3个水平，按L9（34）正交表设计4因素3水平的正交试验（见表1），以总黄酮得率为考察指标，每次试验重复3次，取平均值作为结果，确定从薄荷叶中提取总黄酮的最佳工艺。

表1 正交因素水平表L9（34）Table 1 The factor levels of design in orthogonal test method

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的绘制

以芦丁标准溶液浓度C为横坐标，以吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线（如图1），得回归方程：A=8.842 9C-0.001 9，R2=0.999 2。

图1 芦丁标准曲线图Fig.1 The standard curve of Rutin

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 乙醇浓度对总黄酮得率的影响

从图2中可知，用浓度40%～50%的乙醇提取总黄酮得率有所增大，而在乙醇浓度为60%时，总黄酮得率有所降低。

图2 乙醇浓度对总黄酮得率的影响Fig.2 The effect of the ethanol concentration on total flavonoids yield

这可能是由于一些醇溶性杂质、色素等成分溶出量增加，这些成分与黄酮类化合物竞争同水分子的结合, 从而导致黄酮类化合物的提取量下降，故选择乙醇浓度为40%～60%做进一步研究。

2.2.2 液料比对总黄酮得率的影响

从图3可知，在液料比10∶1和20∶1之间，总黄酮得率增加幅度最大，而液料比30∶1、40∶1、50∶1之间，总黄酮得率减小幅度不大，而且总黄酮得率均比液料比10∶1的得率高得多。

图3 液料比对总黄酮提取率的影响Fig.3 The effect of the liquid-material rate on total flavonoids yield

这可能是乙醇溶液太少以致未能完全浸没叶粉，使得在超声提取中，叶粉未能与乙醇接触完全，细胞难以完全破碎，故选择液料比20∶1、30∶1、40∶1做进一步研究。

2.2.3 超声时间对总黄酮得率的影响

从图4可知，随着超声提取时间的延长，总黄酮得率逐渐提高，但超声波处理40 min后得率降低。

图4 超声时间对总黄酮提取率的影响Fig.4 The effect of the extraction time on total flavonoids yield

这可能是因为长时间超声处理对黄酮的结构和生物活性产生了破坏作用，故选择超声提取时间30 ～50 min做进一步研究。

2.2.4 水浴温度对总黄酮得率的影响

从图5中可知，随着温度的升高，总黄酮得率也有所增加，但水浴温度达到60℃后，总黄酮得率有所降低。

图5 水浴温度对总黄酮得率的影响Fig.5 The effect of the extraction temperature on total flavonoids yield

这有可能是因为温度过高对黄酮造成一定程度的破坏，故选择水浴温度为50℃～70℃做进一步研究。

2.3 正交试验结果与分析

优选出薄荷总黄酮最佳提取工艺：提取液乙醇的浓度为40%，液料比为30:1，超声波提取时间40min，水浴温度50℃。超声波提取薄荷叶总黄酮时各因素影响大小顺序为：B＞C＞D＞A，即液料比＞提取时间＞水浴温度＞乙醇浓度（如表2）。

表2 正交实验结果Table 2 The results of orthogonal test

超声波提取技术（Ultrasonic Wave Extraction）是利用超声波产生的强烈的空化效应、机械振动、高的加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌作用，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速药物有效成分进入溶剂，促进提取的进行[4]。余炼等人[5]以乙醇为溶剂，采用超声波提取蚕沙中的类黄酮，得率为2.358%（即23.58 mg/g），相较于李岩亮[6]采用乙醇提取蚕沙中的黄酮得率0.643%（即6.43 mg/g），提高了近4倍。传统的提取分离方法 (如煎煮法等)存在活性成分提取率不高、 杂质清除率低等问题，这些根本问题制约了中药开发的进程。近些年来，一些新技术如超声波提取法、超临界流体萃取等技术被广泛应用于植物活性物质的提取，但超临界流体萃取技术仪器设备费用昂贵、操作繁琐，超声波提取法仪器设备相对廉价。我们的实验表明，利用超声波提取薄荷叶总黄酮的办法可行，而且方法简单，快速，操作安全，为薄荷叶总黄酮得提取方法提供了很好的理论依据。

该实验表明，利用超声波提取薄荷叶总黄酮的方法简单，快速，操作安全。

3 结 论

采用分光光度法测定总黄酮含量，以乙醇浓度（A）、液料比（B）、超声提取时间（C）和水浴温度（D）为考察因素，通过单因素试验和正交试验优选提取工艺。结果影响薄荷总黄酮提取效果的主次因素为：B＞C＞D＞A，优选出薄荷总黄酮最佳提取工艺为B2C2D1A1，即液料比为30∶1，超声波提取时间40 min，水浴温度50℃，提取液乙醇的浓度为40%。在该工艺条件下，薄荷总黄酮得率为9.89%。说明采用超声波提取工艺方法简单、安全、快速。

[1] 肖培根.新编中药志: 第三卷[M] .北京:化学工业出版社，2002.

[2] 张改先.薄荷及其所含成分的药理毒理研究与临床应用[J].山西职工医学院报,2010,11(4):86.

[3] 荣维燕,郭 斌. 超声波辅助提取紫苏叶总黄酮的工艺研究[J]. 安徽农业科学,2009,37(34):17070-17071,17074.

[4] 刘辉琳, 唐明林; 安莲英等. 中草药化学成分提取新技术[J].广州化学,2003,28(2):61.

[5] 余 炼, 孙 伟, 徐文炘, 等. 蚕沙中类黄酮的超声波提取及纯化工艺研究[J].广西轻工业,2010,(6):6-8.

[6] 李岩亮. 蚕沙中黄酮类化合物提取及纯化的研究[J].辽宁丝绸,2006,(2):10-12.

Opimization of ultrasound-assisted extraction of total flavonoids from Mentha haplocalyx by orthogonal test

YU Lin-hua, FANG Xi, TIAN Chun-yan, SU Heng-feng
(School of Life Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

To study the optimum extraction process of total flavonoids from mentha haplocalyx, with Rutin as a standard and the Mentha haplocalyx as the subject, the percent of total flavonoids was tested by spectrophotometer. During the extracting process, concentration of ethanol（A）, liquid-material rate（B）,extraction time（C）, extraction temperature（D）were studied by using single-factor experiment. Based on the single factor analysis method, the best conditions of extracting total flavones were optimized by orthogonal.The factors which influenced the extraction rate were sorted as followings: B＞C＞D＞A.The optimum extraction process of total flavones from mentha haplocalyx was B2C2D1A1, liquid-material rate 30∶1, ultrasonic extraction time 40 minutes, extraction temperature 50℃, ethanol concentration 40%.Under the conditions, the total flavonoids yield was 9.89%.The ultrasonic extraction method is simple,safe and fast.

Mentha haplocalyx; orthogonal test; total flavonoids; ultrasonic extraction

S567.23+5

A

1673-923X(2012)08-0094-04

2012-05-15

喻林华（1977—），女，湖南宁乡人，讲师，硕士，主要从事生物技术方面的研究

方 晰（1968—），女，广西邕宁人，教授，博士，主要从事生态学方面的研究；E-mail：Fangxizhang@sina.com

[本文编校：吴 彬]