杂交法检测重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)发酵产物HBsAg外源基因拷贝数

张海春，李贵兴，陈广东，张 平，范艳云

(大连汉信生物制药有限公司，辽宁大连 116600)

杂交法检测重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)发酵产物HBsAg外源基因拷贝数

张海春，李贵兴，陈广东，张 平，范艳云

(大连汉信生物制药有限公司，辽宁大连 116600)

以汉逊酵母宿主基因组DNA和发酵产物基因组DNA的相同MOX启动子的片断为特异性探针，用地高辛标记后，与固定在杂交膜上的宿主基因组DNA和发酵产物基因组DNA进行杂交并显色，根据显色深度来判定发酵产物中外源基因拷贝数的大小。结果表明，发酵产物中HBsAg外源基因拷贝数不小于30个。该方法检测灵敏度较好，特异性较强，操作较安全，可用于重组汉逊酵母发酵产物中HBsAg外源基因拷贝数定性检测。

宿主菌基因组DNA;发酵产物基因组DNA;外源基因拷贝数

随着现代生物技术的发展，越来越多的重组产品投放市场。国内以汉逊酵母作为宿主菌进行表达的重组产品中外源基因拷贝数的检测方法报道很少，为此有必要建立通过地高辛标记探针来检测重组汉逊酵母外源基因拷贝数检测方法，以检测发酵产物的稳定性，确保HBsAg在发酵产物中表达的水平。

1 材料与方法

1.1 材料

汉逊酵母宿主菌ATCC34438购自美国菌种保藏中心［1］;重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)发酵产物由大连汉信生物制药有限公司制备;DNA提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收纯化DNA试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司;Hybond－N(带正电荷)尼龙膜购自英国Amersham Pharmacia biotech公司;DNA标记和检测试剂盒购自Roche。

1.2 仪器

TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice TP600，DZF－3型真空干燥箱(上海福马实验设备有限公司)，HH－4型数显恒温水浴锅(常州国华电器制造有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 宿主菌/发酵产物基因组DNA的制备

宿主菌菌体和发酵产物菌体用酸洗玻璃珠破碎后，通过DNA提取试剂盒制备。

1.3.2 样品纯度及浓度检测［2］

通过1%琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法测定DNA纯度和浓度，于－20℃冻存备用。

1.3.3 探针DNA片段的制备

PCR法扩增:按顺序在200 μL离心管中依次加入10X Taq DNA聚合酶缓冲液5 μL，dNTP液 4 μL，引物1(20 μmol·L－1)1 μL，引物2(20 μmol· L－1)1 μL，宿 主 菌 基 因 组 DNA 模 板1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.25 μL，补加灭菌注射用水至50 μL，混匀。按下列步骤循环:95℃2 min;94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，循环30次;72℃ 10 min。

琼脂糖凝胶回收纯化DNA试剂盒回收探针DNA片段。

1.3.4 探针DNA标记和标记率检测

探针标记:取1 μg探针DNA加灭菌注射用水至15 μL，沸水中煮沸10 min，在冰浴中迅速冷却 5 min，再加入2 μLhexanucleotide mixture 、2 μL dNTP labeling mixture 、1 μL Klenow enzyme ，混合后短暂离心，于37℃恒温水浴锅中反应20 h。取出后置65℃水浴中孵育10 min终止反应。加入3 mol·L－1乙酸钠溶液 2 μL，－20 ℃预冷的无水乙醇 80 μL，于 －20 ℃ 作用 2 h，12 000 r·min－1离心15 min，弃上清，加入－20℃预冷的75%乙醇溶液100 μL洗涤沉淀一次，弃上清，室温吹干后加入10 μL TE缓冲液溶解沉淀，即为标记的探针DNA。

1.3.5 探针标记率检测［3］

取DIG－Labeled Control DNA稀释成1 ng·μL－1，分别依次稀释至 10，3，1，0.3，0.1，0.03，0.01 pg·μL－1。同时取标记好的探针，按照上述方法依次稀释，然后分别取各浓度点样1 μL于尼龙膜上，经固定和封闭后，通过AP缓冲液和NBT/BCIP进行显色反应，比较两者显色深浅从而确定标记探针的浓度。

1.3.6 外源基因拷贝数检测

将准备好的发酵产物基因组DNA样品与宿主菌基因组DNA样品、DNA稀释液置100℃水浴中加热10 min，迅速冰浴冷却，以8 000 r·min－1离心5 s，然后点膜，120℃干烤30 min固定，杂交过夜，之后用AP缓冲液和NBT/BCIP进行显色反应，与宿主菌基因组DNA单拷贝数进行比较，根据颜色深浅判定发酵产物中HBsAg外源基因拷贝数的大小。

1.3.7 杂交及显影

杂交及显色过程均按照罗氏地高辛试剂盒的操作手册进行，略有改动。

1.3.8 重现性

按照上述检测方法，对2批发酵产物进行2次测定，比较2次结果，考察该检测方法的重现性。

2 结果与讨论

2.1 宿主菌和发酵产物基因组DNA［4］

部分从菌体中提取出的宿主菌基因组DNA和发酵产物基因组DNA电泳图，如图1和图2。结果表明，制备的基因组 DNA无RNA存在。A260/A280比值为 1.80 和 1.82，纯度符合要求。

图1 宿主菌基因组DNA电泳图

图2 发酵产物基因组DNA电泳图

2.2 探针标记效率的检测

探针标记效率的检测结果如图3。标记探针0.1pg稀释点可见显色，表明标记探针达到预期的标记效率，而且效率较高。经比较两者显色深浅，表明标记达到了要求的量，确定探针浓度为100 ng·μL－1。

图3 探针标记效率检测图(阳性对照)

2.3 发酵产物中外源基因拷贝数的检测

对2批发酵产物进行了HBsAg外源基因拷贝数检测，如图4。

图4 重组汉逊酵母发酵产物外源基因拷贝数检测图

由图4可看出，发酵产物DNA的30倍稀释显色深度不小于宿主菌基因组DNA的显色深度，说明发酵产物HBsAg外源基因拷贝数不小于30个。

2.4 讨论

通过采用地高辛标记探针的杂交法，对重组汉逊酵母发酵产物中外源基因拷贝数进行定性检测，结果证明该方法具有较好的灵敏度和特异性，可以用于重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)生产过程中的质量控制，从而保证其稳定性，也可以为其他重组汉逊酵母生物制品中外源基因拷贝数的检测提供参考。提取DNA的菌体材料最好是新鲜培养的菌体，这样易于DNA的提取，同时提取的DNA不应被RNA或蛋白污染，否则将会影响到紫外定量的准确性。使用DNA回收试剂盒进行探针用DNA的回收，最好做进一步的纯化，否则回收产物中会携带一定量的凝胶小颗粒，这些小颗粒会吸附探针并且会结合到膜上，影响杂交结果的观察。

3 结语

本实验成功建立了外源基因拷贝数的检测方法。此实验所涉及的操作方法难度小，检测成本相对较低，但操作周期较长，中间环节繁琐，结果受干扰的因素较多。相信随着生物技术的发展，此方法会得到进一步的改进，同时应加快新方法的探索。

［1］苏彩霞，张萍，顾美荣，等.重组HBsAg在汉逊酵母中的分泌表达［J］.中国生物制品学杂志，2009，22(2):158－161.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京:中国医药科技出版社，2010.

［3］周长发，张锐，张晓，等.地高辛随机引物法标记探针的southern杂交技术优化［J］.中国农业科技导报，2009，11(4):123 －128.

［4］刘君，张振龙.地高辛标记探针检测重组人干扰素β1b中DNA残留量［J］.微生物学免疫学进展，2007，35(2):19－21.

Hybridization Detection of Copy Number of HBsAg Foreign Gene in Fermentation Products of Recombinant Hepatitis B(Hansenula)

ZHANG Hai－chun，LI Gui－xing，CHEN Guang－dong，ZHANG Ping，FAN Yan－yun
(Department of R＆D，Dalian Hissen Bio－Pharmaceutical INC，Dalian Liaoning 116600，China)

The same MOX promoter fragments of Hansenula yeast host genomic DNA and fermentation products genomic DNA are taken as specific probes.Then the specific probes with digoxigenin labeled are hybridized and been color with host genome DNA fixed in the hybrid membrane and fermentation products genome DNA.The copy number size of foreign gene in fermentation product according to the color depth can be determined.The results show that the copy number of HBsAg foreign gene in fermentation product is not less than 30.The method has such advantages as better detecting sensitivity，stronger specificity and good safety.Therefore，it can be used in qualitative detection of copy number size of HBsAg foreign gene in fermentation product of recombinant Hansenula yeast.

host genomic DNA;fermentation products genomic DNA;foreign gene copy number

O621.14

A

1009－315X(2012)01－00012－03

2011－07－17;最后

2011－09－13

张海春(1978－)，女，满族，河北秦皇岛人，主要从事重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)工艺质量控制研究。

(责任编辑 邹永红)