蛋白质“酶解度”概念的探究

刘宝全，王剑锋，李春斌，范圣第

(大连民族学院生物化学工程－国家民委－教育部重点实验室，辽宁大连 116605)

蛋白质“酶解度”概念的探究

刘宝全，王剑锋，李春斌，范圣第

(大连民族学院生物化学工程－国家民委－教育部重点实验室，辽宁大连 116605)

分析了蛋白质水解度参数在监测蛋白质酶解过程中的不足，并根据蛋白质酶解过程特点提出了酶解度的概念与测定方法。将酶解度定义为一个比值，用于描述蛋白质酶解体系中新增肽链数相对于原有肽链数的变化，可以有效反映酶对蛋白质的酶切过程。根据酶解度的定义，只要分别测定出酶解前的体系中肽链数目与酶解后体系中的肽链增量，通过计算两者的比值就可以计算出该条件下的酶解度。体系中的肽链数目可以通过甲醛滴定法测定出体系中的游离氨基数与新增游离氨基数来计算。

酶解度(DEH);蛋白质;酶;水解

蛋白质可以在酸(或碱)的作用下水解形成氨基酸，用于氨基酸制备或蛋白质的组成氨基酸鉴定分析。在利用酸(或碱)水解蛋白质进行氨基酸工业生产的过程中，为监测蛋白质的水解程度，提出了蛋白质水解度(Degree of hydrolysis，DH)的概念［1－2］。水解度通常用蛋白质全部肽键被水解的百分比表示，即已经水解的肽键占蛋白质水解前肽键总数的百分比［1－2］。本文作者在从事蛋白质酶解过程研究中发现，在进行未知蛋白质(尤其是少数民族地区的特色资源中的蛋白质组分)的酶解实验时，根本无法找到相关的数据用于计算体系中的蛋白质底物的肽键数目，利用蛋白质水解度不能很好地开展未知蛋白质的酶解进程，由此特别提出了蛋白质的酶解度概念，从而为蛋白质酶解过程分析提供一种新的更有效的方法打下基础。

1 利用水解度监测蛋白质酶解过程的不足

蛋白质的酸(或碱)水解与蛋白质酶解的最大区别在于，酸(或碱)水解对氨基酸序列没有选择性，而酶(特别是内切酶)酶解对蛋白质的氨基酸序列有选择性，只能在特定的位置上进行氨基酸链的切割。为了便于计算，以一个由1 001个氨基酸构成的蛋白质为例，在进行酸碱水解时，酸(或碱)可以在任一位置断裂肽键，最后得到构成该蛋白的各种氨基酸;每水解一个肽键，其水解度就增加0.1%，最后达到100%。

蛋白质的酶解与酸(或碱)水解不同，酶对蛋白质底物有氨基酸排列顺序的要求。构成蛋白质的氨基酸有20种，如果随机排列，某一个特异的三氨基酸排列出现的机率只有1/8 000。假设上述由1 001个氨基酸组成的蛋白中有100个某个特异性内切酶的识别位点(这在真实蛋白中是不可能的);用这种酶对该蛋白质进行水解时，最终的水解度最大值也仅有10%，还有90%的肽键未被水解。对底物序列有高度选择性的Xa因子(识别与切割序列为:－Ile－Glu－Gly－Arg↓X)，在重组蛋白中只有一个人为添加的识别与切割位点，如果也是对一个由1 001个氨基酸组成的重组蛋白进行切割，水解度最高也只有0.1%;当研究酶解动力学时，各种因素对水解度的影响必定都在0.1%以内;如果底物蛋白质中肽键的一半都被酶解时，其水解度也仅为0.05%。

用水解度研究蛋白质的酶解过程，不仅因水解度非常低而造成表述问题，还有一个关键的制约因素，那就是:如果要计算蛋白质水解度，就一定要先测定出蛋白质中的肽键总数(即组成氨基酸数目)。这对于全部序列已知的重组蛋白来说较为容易，对于从生物体分离出来的非重组蛋白则较为困难，大多数天然蛋白质都不知道其准确的氨基酸组成，一般都要经过复杂的蛋白质分子量分析与氨基酸组成分析，才能知道其准确的肽键数目。所以要测未知蛋白的酶解，一般只做分子量分析，再根据氨基酸的平均分子量，估算蛋白的氨基酸组成数目，进而计算蛋白质的水解度。此时计算出的水解度不能是一个精确的数据。

针对利用水解度研究蛋白质酶解过程中存在的数值低、计算肽键总数困难的两点不足，我们提出了蛋白质的酶解度概念。

2 蛋白质酶解度的定义

蛋白质是由氨基酸通过肽键依次连接构成的线性结构，一端是游离的氨基，另一端为游离的羧基。当蛋白质发生酶解时，蛋白质中的一个肽键被水解，就形成一个新的游离氨基与一个新的游离羧基;同时多肽链由一条变为两条，每一条新肽链都有一个原来的游离氨基(或羧基)和一个新形成的游离羧基(或氨基)。所以可以利用游离的氨基(或羧基)来监测蛋白质的酶解进程，并依此定义蛋白质的酶解度(Degree of enzymatic hydrolysis，DEH)。蛋白质酶解度(DEH)是指酶解体系中新增肽链总数与酶解前肽链总数的比值。

式中，AN表示体系中的游离氨基总数，A取自英文单词amount，N代表蛋白质氨基末端，下角标0表示反应起始阶段，下角标1表示酶解反应进程中第一次取样测定结果。同理，也可以用AC代表体系中的游离羧基总数，DEH的计算公式更替为

由于蛋白质酶解时，要向体系中添加蛋白酶;而蛋白酶本身也有游离氨基与游离羧基，在测定酶解进程时，要将体系中蛋白酶的游离氨基(或羧基)扣除，所以计算公式修正为

式中，ANE和ACE分别代表体系中添加的蛋白酶的游离氨基和游离羧基数目。

为简化计算，仅以一条蛋白质多肽链进行酶解分析。当一条多肽链进行酶解时，发生一次酶解，其酶解度DEH通过式(3)或式(4)计算可知，DEH值为1;2次酶解时，DEH值为2;3次酶解时，DEH值为3。从以上结果可知，利用蛋白质酶解度能非常好地体现酶解进程。

在实际计算过程中，式(3)与式(4)可以变形为

在计算公式中，ANE、AN0、ACE、AC0均在反应前进行测定，在酶过程中是常数，反应进程监测主要是测定AN1或AC1。当酶的浓度远远小于蛋白质底物浓度时，ANE/AN0和ACE/AC0可以忽略不计，蛋白质的酶解度计算公式简化为

根据简化式(7)和式(8)，只要测出酶解后体系中的多肽链数目与反应前的多肽链数目比，就可以非常简便地算出酶解度。这在利用分光光度法测定中非常有用，只要在测定体系的线性范围内，可以直接利用光吸收值进行DEH值计算，使反应监测更易于进行。

3 蛋白质酶解度的甲醛滴定法测定

进行蛋白质酶解度测定，不需要将样品完全水解，只要能有效测定反应体系中的多肽链数目变化，就可以计算蛋白质的酶解度。确定反应体系中的多肽链数目，最重要的方法是测定体系中的游离氨基数目。在蛋白质水解度测定的相关方法［1］中，只要能有效测定反应体系中氨基或羧基数目，都可以用于蛋白质酶解度的测定。下面重点介绍简便易行的甲醛滴定法。

甲醛滴定法［2－3］的基本原理是利用甲醛与多肽链中的游离氨基结合形成羟甲基衍生物，使原来与氨基结合的氢离子解离出来，再用标定的碱进行滴定，新消耗的标定碱的摩尔数就是体系中新增加游离氨基的摩尔数。一般选用酚酞做滴定指示剂，分别测定添加甲醛前后滴定到酚酞变色时的标定碱的用量，即可计算出体系中因加入甲醛而释放的氢离子摩尔数，从而计算出体系中新增的游离氨基数目。具体的操作方法将在下期的“甲醛滴定法测定牛血清白蛋白的酶解度”论文中详细论述。

虽然蛋白质侧链中的游离氨基会造成测定的初始多肽链数目偏高，但是在根据式(3)计算新增加游离氨基数目时，蛋白质侧链中的游离氨基对测量结果的干扰可以通过2次测定值相减(AN1－AN0－ANE)而有效消除。利用甲醛滴定法可以较为准确地计算出反应前后体系中的游离氨基的数目变化，进而通过计算酶解度来监测蛋白质的酶解进程。

［1］徐英操，刘春红.蛋白质水解度的测定方法综述［J］.食品研究与开发，2007，28(7):173 －176.

［2］徐勤，葛向阳，刘建峰.甲醛法测大豆蛋白水解度的改进［J］.饲料工业，2008，29(5):46－47.

［3］张龙翔，张庭芳，李令媛.生化实验方法和技术［M］.北京:高等教育出版社，1997.

Exploration of Conception of Degree of Enzymatic Hydrolysis

LIU Bao－quan，WANG Jian－feng，LI Chun－bin，FAN Sheng－di
(Key Laboratory of Biochemistry Engineering of the State Ethnic Affairs Commission－Ministry of Education，
School of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian Liaoning 116605，China)

The major defects of DH(degree of hydrolysis)were discussed，and the conception and determination methods of DEH(degree of enzymatic hydrolysis)were developed in this article.The DEH was defined as a ratio between the addition of peptide chains and the amounts of origin peptide chains of the protein in enzymatic system to determine the degree of enzymatic hydrolysis of protein.When the amounts and addation of peptide chains were determined and calculated，the value of DEH would obtained according to the conception of DEH.The amounts of free amino groups，determined by formol titration，could be used to calculate the value of DEH.Key words:degree of enzymatic hydrolysis;protein;enzyme;hydrolysis

Q519

A

1009－315X(2012)01－0009－03

2011－10－27

教育部科学技术研究重点项目(2010－263);国家民委项目(09DL08);辽宁省教育厅资助项目(2009A154);大连民族学院引进人才启动基金资助项目(20096102)。

刘宝全(1972－)，男，蒙古族，辽宁北票人，讲师，博士，主要从事化学与生物学交叉学科研究。

(责任编辑 邹永红)