瘦肉精三合一胶体金快速检测板的研制及在畜肉中的应用

王 森，周亚莲，盛慧萍，桑丽雅，马秋玲，杨光瑞，周建昌

(1.浙江省绍兴市农业科学研究院，浙江 绍兴 312000;2.杭州南开日新生物技术有限公司，浙江杭州 310022)

瘦肉精是一类 β-肾上腺受体激动剂，β-肾上腺素受体激动剂 (简称β-兴奋剂)是具有苯乙醇胺结构的一类物质，可分为含取代基的苯胺型(如盐酸克伦特罗)、苯酚型 (如沙丁胺醇)、苯二酚型 (如特布他林)三大类，主要包括盐酸克伦特罗、莱克多巴胺以及沙丁胺醇、溴布特罗、溴氯布特罗、马布特罗等［1］。

β-受体激动剂早期主要用于防治人、动物支气管哮喘和支气管痉挛，后来研究发现在饲料中添加这类药物具有营养再分配作用，促进动物生长和改善动物胴体结构，提高瘦肉率的作用，因此，该类药物曾被作为一种药物促生长添加剂被广泛用于动物生产［2］。但是人们食用了残留有这些药物的畜肉产品后会出现面色潮红、头痛、头晕、胸闷、心悸、四肢麻木等不良反应症状，严重的可能危及生命［3-4］。因此，欧盟、美国等都先后立法禁止在畜禽生产上使用该类药物，我国农业部公告第235号(2002)规定严禁在畜牧生产上使用各种β-兴奋剂类药物［5］。

目前，国内外动物性食品中β-受体激动剂在实验室内的检测方法主要是气相色谱-质谱法(GC-MS)［6-7］，GC-MS 作为确证方法具有灵敏度高、精确性好的优点，但操作烦琐、成本高。瘦肉精胶体金快检卡是当前β-兴奋剂类检测最主流的现场快速筛选方法，市场占有率远远超过酶联免疫吸附法 (ELISA法)，以检测尿液为主，但尿样检测存在弊端。相对来说，检测畜肉组织中β-兴奋剂残留量更为稳定和准确。本研究研制了一种检测畜肉组织中3种瘦肉精残留的胶体金快速检测板。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

盐酸克伦特罗 (CLEN)、莱克多巴胺(RAC)、沙丁胺醇 (SAL)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白 (OVA)、氯金酸 (HAuCl4·4H2O)、羊抗鼠IgG均购自美国 Sigma公司;聚乙二醇20000购自华东医药有限公司;硝酸纤维素膜、胶体金结合垫、样品垫均购于Millipore公司;抗盐酸克伦特罗单克隆抗体、抗莱克多巴胺单克隆抗体、抗沙丁胺醇单克隆抗体均由杭州南开日新生物技术有限公司提供。

1.1.2 仪器

Avanti J-26XP高速冷冻离心机 (美国 Becman公司)、UV-2802紫外连续扫描分光光度计 (美国UNICO公司)、78HW-1恒温磁力搅拌器 (杭州仪表电机有限公司)、恒温鼓风干燥箱 (上海精宏实验设备有限公司)、BioJet XYZ3000型点膜仪 (美国BioDot公司)、切割机 (杭州市恒通设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 特异性结合抗原的制备及鉴定

盐酸克伦特罗特异性结合抗原的制备采用重氮法。称取100 mg BSA，用10 mL 0.1 mol·L-1pH值10.0的碳酸钠缓冲溶液溶解，得到溶液A。另外称取20mg盐酸克伦特罗，用2mL 0.5 mol·L-1的硫酸溶液溶解，混匀后加入300 μL 10 mg· mL-1的亚硝酸钠，持续反应2 h，得到溶液B。在搅拌下，将溶液B逐滴加入溶液A中，混匀后，置于4℃下避光反应5 h(期间可颠倒混匀)，之后用0.01 mol·L-1pH值7.4的 PBS缓冲液透析4 d，期间每间隔8 h换液1次。再将溶液离心，收集上清液，-20℃下冻存备用。

莱克多巴胺特异性结合抗原的制备采用混合酸酐法。34 mg盐酸莱克多巴胺溶于2 mL吡啶，加入12 mg戊二酸酐;室温下搅拌过夜;氮气吹干吡啶;0.1 mmol·L-1莱克多巴胺半抗原溶解到4 mL DMF N'N-二甲基甲酰胺 ∶1，4-二氧六环 (V∶V为1∶1)，添加26.2 μL三正丁胺;上述混合物冰浴搅拌10 min，加入14.3 μL氯甲酸异丁酯，恢复到室温，搅拌反应1 h;上述混合物逐滴加入到预冷BSA溶液中 (100 mg BSA溶于pH值8.5 0.1 mol·L-1硼酸钠溶液)，混合物恢复到室温，搅拌过夜;用0.01 mol·L-1pH值7.4的 PBS缓冲液透析3 d，每天换液3次。

沙丁胺醇特异性结合抗原的制备采用混合酸酐法。称取240 mg沙丁胺醇碱，用20 mL甲醇溶解;旋转蒸发为黄色油状物;再用无水乙醇溶解，逐滴加入乙醇溶解的120 mg丁二酸酐;氮气保护条件下，室温搅拌4 h;将反应液离心，弃上清液;用无水乙醇洗涤沉淀物3次;挥干溶剂所得白色固体即半抗原沙丁胺醇半琥珀酸。

称40 mg半琥珀酰沙丁胺醇，溶于1，4-二氧六环-水-三乙胺的混合物中;搅拌下逐滴加入30 μL氯甲酸异丁酯 (30 min内);将上述反应液逐滴加入到25 mL含80 mg BSA的蒸馏水中;4℃反应过夜;0.01 mol·L-1pH值7.4的PBS缓冲液透析3 d，每天换液3次。

抗原的鉴定。合成的盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇特异性结合抗原稀释成 100 μg·mL-1(蛋白浓度)后做200～400 nm波长的紫外扫描。比较半抗原、载体蛋白和偶联物的紫外光谱图，判断偶联是否成功。

1.2.2 抗体-胶体金标记物的制备

胶体金溶液的制备。采用柠檬酸三钠法［8］，制备粒径为30 nm左右的胶体金溶液。

标记前分别将抗盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇单克隆抗体溶液以1 5 000 r·min-14℃离心30 min，取上清液;取已制备好的胶体金溶液100 mL，用 0.1 mol·L-1K2CO3和 0.1 mol·L-1HCl将胶体金溶液的pH值调至8.0～8.2。边搅拌边分别加入最适量的单克隆抗体，加入蛋白质时应逐滴加入，1 mg的蛋白质大约5 min加完;在搅拌下加入5%的BSA使其终浓度为1%，或加入3%聚乙二醇 (PEG MW 20 000)使其终浓度为0.05%;12 000 r·min-1离心 25 min，弃上清液;加入10 mL 0.01 mol·L-1pH值 7.4的 PBS缓冲液 (含 0.4 mol·L-1PEG 20 000)，12 000 r·min-1下离心25 min，弃上清液，如此洗涤 2～4次，以彻底除去未结合的蛋白质;将沉淀用10 mL含2% BSA的 PBS缓冲液 (pH值7.4，0.01 mol·L-1)溶解;用0.22 μm无菌过滤器过滤后，4℃保存备用。

1.2.3 检测板大卡的组装

检测线、控制线及胶体金结合垫的包被。

用点膜机把适当质量浓度的特异性结合抗原(CLEN-BSA、RAC-BSA、SAL-BSA)、羊抗鼠 IgG喷在硝酸纤维素膜 (NC膜)上，分别作为检测线(T线)和控制线 (C线)。

将制备好的金标记单克隆抗体用点膜机喷到玻璃纤维素膜上，作为胶体金结合垫。

特异性结合抗原、羊抗鼠IgG和金标抗体包被量的选择方法。在 T线粗调范围0.6～1.0 mg·L-1内和C线粗调范围0.6～1.5 mg·L-1内，选择一组质量浓度，按常规喷量0.8～1.0 μL·cm-1包被到NC膜上，60℃干燥箱放置2 h。将制备好的金标记抗体溶液选择不同包被量(1.0～2.0 μL·cm-1)包被到玻璃纤维素膜上，33℃烘箱干燥12 h。

检测板各组分的组装。将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫用不干胶依次粘贴在底板上组装成大卡 (图1)。

1.2.4 检测板各组分的优化

图1 检测板的结构组成

用切割机将组装好的大卡切割成4 mm宽的试纸条，装入塑料模板中组装成三合一检测检测板(图 2)。

用 0.01 mol·L-1、pH 值 7.4的磷酸盐(PBS)缓冲液和含1.0 μg·L-1盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的标准品溶液，各取100 μL分别进行试纸条滴定，观察显色变化和试纸条灵敏度，反复调试，最终选择显色深浅适中、灵敏度最高、梯度最大的一组特异性结合抗原、羊抗鼠IgG和金标抗体质量浓度作为最终配比。

图2 盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇胶体金快速检测检测板

1.2.5 样品前处理

样品粗提处理。称取4 g左右剪碎的畜禽肉样本装于5 mL刻度冷冻管中，盖紧管盖，于90℃以上水浴锅中煮10 min;冷却至常温后，取3滴煮出的溶液 (尽量吸取肉汁中上清)于1.5 mL离心管中，再加入3滴CLEN专用PBST缓冲液，充分混合，待检。L样品精提处理。取去脂肪组织样本于均质机中均质1 min(10 000 r·min-1);称取2.5 g均质物于15 mL离心管中，加入5 mL 0.1 mol·L-1HCl，振荡混匀 10 min;加入 100 μL 4 mol·L-1NaOH，剧烈振荡30 s后，室温下4 000 r·min-1离心15 min;转移全部上清于15 mL离心管中，加入 50 μL 4 mol·L-1NaOH，振荡混匀，再加入8 mL乙酸乙酯，振荡5 min;取上层有机相6 mL于试管中，65℃氮 (空)气吹干;向吹干的试管中依次加入0.3 mL正己烷和0.3 mL RAC专用PBST缓冲液，充分溶解试管壁上残留物，静置分层后，吸取至少100 μL下层溶液检测。

1.2.6 检测步骤及结果判断

用滴管吸取待检样品，垂直滴加3滴 (约100 μL)于每个加样孔中，加样后开始计时;结果应在3～5 min读取，其他时间判读无效。

肉眼观察样品检测结果，检测线 (T线)显色比控制线 (C线)深或一样深为阴性 (表明样品中对应待检药物浓度低于检出限，或不含待检药物，图3中a);检测线 (T线)比控制线 (C线)浅，或检测线 (T线)无显色为阳性 (表明样品中对应待检药物大于等于检出限，图3中b)。未出现C线，见图3中c，可能是操作不当或检测板已失效，应重新进行测定。

图3 免疫胶体金快速检测检测板结果的判断

1.2.7 检出限测定

取经 LC-MS/MS法［9］确证的阴性畜禽肉样品，分别添加CLEN、RAC、SAL标准品溶液制成含量为0，3.0，5.0，8.0 和10.0 μg·kg-1的样品各10个，样品通过粗提处理和精提处理后用本研究制备的三合一检测板进行测定，确定检出限。

1.2.8 与仪器方法的比对

随机取10份畜禽肉样品，作为供试试样。每份样品分别用LC-MS/MS法和本研究制备的瘦肉精三合一快速检测板进行检测，比较检测结果。

2 结果与分析

2.1 特异性结合抗原的鉴定

盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇特异性结合抗原的紫外扫描图谱 (图4)。通过图谱可以看出，偶联后的 CLEN-BSA、RAC-BSA、SAL-BSA的特征吸收波峰均发生偏移，根据吸光度加合性原理，表明偶联成功。

图4 紫外扫描的图谱

2.2 检出限

CLEN、RAC、SAL含量为 0，3.0，5.0，8.0和10.0 μg·kg-1的样品通过粗提处理后，用瘦肉精三合一胶体金快速检测板进行检测，结果含量为0和3.0 μg·kg-1的样品检测结果均为阴性，含量为5.0，8.0和10.0 μg·kg-1的样品检测结果均为阳性，故该检测板对畜禽肉样品中 CLEN、RAC、SAL的检测限为5.0 μg·kg-1(简单前处理)。检测板检测显色结果见图5。CLEN、RAC、SAL含量为 0，0.5，1.0和 2.0 μg·kg-1的样品通过精提处理后，用检测板进行检测，结果含量为0和0.5 μg·kg-1的样品检测结果均为阴性，含量为1.0和2.0 μg·kg-1的样品检测结果均为阳性，故该检测板对畜禽肉样品中CLEN、RAC、SAL的检测限为 1.0 μg·kg-1(复杂前处理)。检测板检测显色结果见图6。

图5 检测板检测0～10.0 μg·kg-1样品的显色结果

2.3 与仪器方法的比对

10份畜禽肉盲样经液相色谱-串联质谱法检测，其中，5份样品未检出瘦肉精残留，另5份样品分别检出阳性 (样品 S-1:CLEN 2.81 μg·kg-1，样品 S-3:CLEN 1.01 μg·kg-1、RAC 1.32 μg·kg-1、 SAL 2.97 μg·kg-1， 样 品 S-5:RAC 2.35 μg·kg-1、SAL 1.43 μg·kg-1，样品 S-8:RAC 3.13 μg·kg-1， 样 品 S-10:SAL 4.62 μg·kg-1)。这些样品同时用瘦肉精三合一胶体金快速检测板检测 (复杂前处理)，结果与液相色谱-串联质谱法检测结果完全符合 (表1)。

图6 检测板检测0～2.0 μg·kg-1样品的显色结果

表1 胶体金快速检测板与液相色谱-串联质谱法检测结果的比较

3 小结和讨论

影响胶体金检测检测板质量的因素较多，除特异性结合抗原、特异性抗体的特性外，还包括胶体金颗粒大小、抗原抗体包被量配比等。

胶体金颗粒制备好坏非常重要。如果金颗粒太小就不能产生足够的颜色信号，导致目测效果较差;如果太大在标记时又会遇到空间位阻的问题。本试验选用了直径为30 nm左右的胶体金。

特异性结合抗原、羊抗鼠IgG和金标抗体包被量是决定检测板灵敏度的3个主要变量。T线上特异性结合抗原包被量过小，显色太淡，会影响视觉效果，反之包被量过大，虽然显色深，但是灵敏度会降低。金标抗体的标记量由抗体特性决定，调试变量是其包被量。包被量的选择依据一是显色深浅，二是灵敏度高低，需反复调试确定最佳配比。

组织中克伦特罗等瘦肉精残留主要是螯合物的形式存在，在碱性条件下利于提取。但是抗原抗体反应需要在近中性的条件下进行，所以样品垫缓冲体系的调节作用至关重要，如果太偏碱，则跑板速度变慢导致显色偏浅。如果太偏酸，会导致主要依靠静电结合的抗体与金颗粒分离，造成检测线和控制线不显色或显色浅，易造成假阳性和假阴性。

本研究制备的瘦肉精三合一胶体金快速检测检测板，一次样品前处理可以同时检测畜禽肉中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇3种瘦肉精药物，检出限低，准确率高，且操作简单快速，特别适合广大基层部门对畜禽样品进行大规模筛选。

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