氮素调节玉米幼穗及籽粒发育的生理机制

米国华，陈范骏，袁力行

(教育部植物-土壤相互作用重点实验室，中国农业大学资源与环境学院，北京 100193)

玉米是全球最重要的多用途作物之一，广泛应用于粮食、饲料、化工、生物能源等行业，因此国内外需求与价格不断攀升。我国玉米高产育种已取得了重大成就，超高产记录不断突破。2005 年，山东李登海育种试范田的夏播玉米产量记录已经达到21.05 t·hm-2。然而，不容忽视的是，目前的高产记录都是高肥高水条件下获得，我国农田氮肥投入量大、氮肥利用率低，是基本公认的事实。20 世纪80 年代以来，我国化肥用量持续高速增长，2007 年已超过5 000 万t，占全球消费总量的35%。每年仅损失的氮肥就在500 万t 以上。据FAO (2005)的数据，在相近的施肥量条件下我国的平均氮效率(氮肥偏生产力)比美国低15 个百分点。据闫丽珍等研究结果，我国玉米生产中的可变成本中，化肥费用最高(占总成本的40%～50%)，其次分别为种子、动力、排灌、畜力、农家肥等。过量的氮肥除了增加农民的经济成本，还对环境造成巨大压力［1］。为了减轻过量氮量对环境污染的压力，美国和欧盟各国都制定了农田氮肥投入量的限制性条款。因此，如何在适当降低施肥量的前提下达到高产，实现高产高效，已成为国家的重大需求。其中蕴含的科学理论问题，需要深入研究。

在科学施肥的前提下，选用高效吸收利用氮素的氮高效品种，是在适当降低施氮量的条件下维持较高产量水平的重要途径之一［2］。国内外有关氮高效生理、遗传基础研究方面已经开展了多年的工作，在氮素吸收转运蛋白基因克隆与功能分析［3］、氮素调节根系发育［4-5］、氮素诱导的基因表达谱［6］、氮高效性状QTLs 定位等方面都取得了重要进展［2，7］。然而这些研究多集中于苗期或短期效应，很少涉及到作物产量器官的形成。而在田间水平上，氮高效的重要性状之一产量器官的性状。以玉米为例，田间供氮不足造成减产的最主要原因的是穗发育不良，穗粒数下降，见图1。深入研究氮素调节玉米幼穗及籽粒发育的控制机制，确定关键的生理与生化过程，对于选育氮高效玉米品种具有重要指导意义。

图1 低氮胁迫对玉米穗发育的影响Fig.1 Effect of nitrogen (N)deficiency on earshoot and grain development in maize

1 氮素对玉米幼穗及籽粒发育的影响

玉米的雄穗、雌穗同株，是典型的异花授粉作物。雄穗着生于茎秆顶部，雌穗由叶腋的腋芽发育而成，是变态的侧枝。雌穗的抽出(抽丝，即开花)比雄穗抽出(抽雄)稍晚。抽丝顺序为:靠近穗基部1/3 处的花丝先抽，而后向上、向下陆续抽丝，顶部花丝抽出最晚。不良的环境条件下，如干旱、缺肥等，对雌穗的抑制作用大于雄穗，使抽雄-吐丝间隔期(ASI)延长，容易造成雌、雄穗花期不遇，花丝受精不良，最终形成秃尖(顶部籽粒败育)，甚至空秆(所有籽粒不结实)。雌穗小花授粉后3 d～16 d 内是胚建成及胚乳细胞分裂期，其后进入籽粒灌浆期，授粉后50 d～55 d，籽粒成熟［8］。因此，抽丝前1 周至抽丝后2 周这段时间，虽然幼穗及籽粒的干物质量很小，却是决定玉米籽粒数及籽粒大小的关键时期［9-10］。

氮素供应不足对玉米幼穗及籽粒发育有强烈的影响。玉米苗期需氮量少，而普通农田土壤及基施氮肥能满足氮素前期需求，所以氮素一般不至缺乏。至抽雄开花期左右时，由于植株生长量较大、土壤氮素耗歇很快，常达到4 kg N·d-1·hm-2～5 kg N·d-1·hm-2［11］。追肥量不足的条件下，此时极易出现缺氮。研究表明，此时轻度低氮胁迫对营养体生物量影响很小，从外观不易察觉，但却导致穗顶部籽粒败育和结实率下降［11-12］。中度及严重缺氮条件下，雌穗发育及抽丝严重受阻，开花-吐丝期间隔时间加长，表现为空杆率显著增加(有效穗数减少)，穗长及穗粒数显著降低［11，13-14］。不同基因型幼穗及粒粒发育对低氮胁迫的敏感性不同，氮高效基因型的穗粒发育显著优于氮低效基因型，表现为结实率、穗粒数和单穗质量显著较高［15-16］。

2 氮素调节玉米幼穗及籽粒发育的生理机制:谷氨酰胺合成酶(GS)的重要性

氮素明显影响幼穗及籽粒发育，但其中的生理学机制尚不很清楚。缺氮条件下植株积累大量糖分，这些糖分进一步转化为花青素等次生代谢产物。因此，碳的供应不太可能成为幼穗及籽粒发育的初级限制因素。缺氮对授粉后10 d 内籽粒中的碳水化合物含量影响不大，而且碳氮比(C/N)还有所增加，也说明碳的供应不是籽粒败育的主要因素。同时，缺氮降低顶部籽粒的酸性转化酶活性［17］，表明碳的利用在籽粒发育过程中起重要作用。然而，由于碳的利用受籽粒发育的调节，很难分清酸性转化酶的变化是籽粒败育的原因还是结果。在氮代谢方面，早期研究表明，籽粒内部的氮代谢过程可能对籽粒的发育有直接作用［18］。研究发现［19］，吐丝后8 d 时，低氮使玉米穗轴中的天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)含量显著下降，其它氨基酸含量变化不显著。但到吐丝后14 d 时，低氮与高氮处理的穗轴中所有氨基酸的含量并没有显著差异。穗轴中的氨基酸转化过程(尤其是从天冬酰胺向谷氨酰胺的转化)可能是反映籽粒氮素供应状况的一个信号，最终决定相应部位籽粒的结实与败育，其中谷胺酰胺合成酶(GS)可能起到关键作用。Martin 等［20］的研究发现，细胞质谷胺酰胺合成酶GS1 活性对玉米籽粒发育具有重要调节作用。该酶在玉米中受5 个基因控制(Gln1 -1～Gln1 -5)，其中Gln1 -3 定位于叶肉细胞，Gln1 -4 定位于叶维管束鞘细胞。将这两个基因分别进行突变后，玉米籽粒数和粒质量分别显著降低，双突变体籽粒数和籽质量均严重下降。在抽丝期，野生型与突变体叶片中的硝酸盐、可溶性糖以及氨基酸水平均没有显著差异，只是突变体中的铵水平显著升高，但在韧皮部汁液中，突变体中除谷氨酸外的各种氨基酸浓度普遍降低。说明这两个基因的作用可能与叶片中氨基酸的合成及其输出有关，因而氮的输出过程可能成为限制幼穗和(或)籽粒发育的重要因素。在玉米中超表达这两个基因后，在高氮供应下增加了籽粒数和籽粒产量(30%)，但在低氮条件下并未发现穗粒发育有显著的改善［2］。由于GS 是植物氮代谢的关键酶，所有的氮化合物几乎都有通过GS 的调节才能进入氮代谢其它途径，所以GS 突变体的结果需要谨慎对待，它只能说明GS 在氮代谢及植物生长发育的重要性，不一定反映低氮胁迫下作物高效利用氮素、维持籽粒正常发育的机理。在正常植株的缺氮条件下，氨基酸由叶片向籽粒的转运是否是限制幼穗及籽粒发育的决定因素?GS 酶活性是否是限制叶片氨基酸转运的关键因素?控制GS 酶的哪个基因起关键作用?尚需要深入进一步探讨。

3 细胞分裂素与氮营养信号传递

细胞分裂素是植物最重要的激素之一，其核心功能是促进细胞分裂与分化。它参与多种植物生理与发育过程的调节，如芽的形成、叶片扩张、延迟衰老、促进种子萌发、调节根系发育等等。大量研究表明，细胞分裂素在作物穗粒发育过程中起到重要调节作用［21］。在作物胚乳建成期籽粒中细胞分裂素水平达到最高峰［22］。在玉米中已发现，细胞分裂素调节穗的分化，外源细胞分裂素供应可以促进雌雄发育，增加玉米雌穗籽粒的数量［23］。

植物细胞分裂素合成的第一步受腺苷磷酸-异戊烯基转移酶(adenosine phosphate -isopentenyltransferase，IPT)控制［24］。该酶催化由二甲基丙烯焦磷酸酯(DMAPP)和AMP (或ADP、ATP)向异戊烯基腺苷核苷单磷酸(IPRMP (N6-isopentenyl adenine riboside 5’-monophosphate)(或异戊烯基腺苷核苷二磷酸IPRDR、异戊烯基腺苷核苷三磷酸IPRTP)的转化。在玉米中发现有9 个IPT 基因(已公布的美国专利)。细胞分裂素信号由His-Asp 双组分调节系统(His-Asp two-component regulatory system)构成，该系统包括3 个模块:细胞分裂素感受器(组氨酸激酶，HK)、磷酸根传递蛋白(HP)和响应调节因子(RR)。最后由响应调节因子调控下游功能基因的表达［24］。玉米中已发现10 个RR 基因［25］。

根据现代植物生物学理论，植物对胁迫反应的上游过程是对胁迫信号的接收与转导。对氮素而言，植物可能感受两个方面的缺氮信号，一是感受根际土壤的氮素水平信号，二是感受植株体内养分状况信号。这些信号通过长距离运输到达特定的反应部位，进而调节相关基因表达及相应的生理与形态学反应。植物激素是环境信号转导过程中的重要组成部分，人们最为熟知的例子是脱落酸(ABA)传导土壤水分亏缺信号。关于氮素信号转导，目前了解虽然还很少，但细胞分裂素介导由根向地上部氮素信号的转导，已经得到大量实验证据的支持［26］，表现为以下几方面:

①在玉米中，根木质部汁液中及叶片中的细胞分裂素的主要形态分别是ZR 和Z，硝酸盐可以快速增加细胞分裂素的合成、细胞分裂素合成酶基因表达［27-28］。在拟南芥中，AtIPT3 受硝酸盐快速诱导，而AtIPT5 受硝酸盐和铵的长期诱导［29］。

②硝酸盐诱导细胞分裂素特异性响应调节因子RR 表达。在玉米的10 个RR 基因中，ZmRR1 和Zm-RR2 受硝酸盐供应的诱导［27-28，30］。在拟南芥中ARR3～ARR7 也受硝酸盐的特异诱导［31］。

③细胞分裂素参与氮素调节的植物形态建成过程。与供应硝态氮相比，供应铵态氮显著抑制烟草叶片细胞分裂及扩张，其原因并不是叶片氮含量不同，而是由根向叶片运输的细胞分裂素下降［32］。高氮抑制玉米根的伸长与细胞分裂素水平升高密切相关［33］。

④细胞分裂素调节硝酸盐吸收与硝酸还原酶活性。短期细胞分裂素处理诱导硝酸盐还原酶基因表达及酶活性，这一点早为人知。但在细胞分裂素合成酶IPT 转基因烟草中，内源细胞分裂素水平过高则抑制NRA 活性［34］。研究还发现，外源或韧皮部中的细胞分裂素供应水平偏高，可以极大地抑制硝酸盐吸收速率［35］。

⑤细胞分裂素调节叶片中氮素的输出。最新研究发现，将A. Tumefaciens 的IPT 基因转入小麦后，延迟叶片衰老的同时，也降低了叶片中15N 向穗粒的运输［36］。

综合相关文献，Sakakibara［25］认为，氮素(硝酸盐)信号具有特异性和非特异性两种，特异性信号主要调节含氮化合物(如氨基酸、核酸等)的合成，而非特异信号则由细胞分裂素介导，主要调节氮化合物分配及植物发育过程，如细胞分裂与叶片衰亡及相应物质输出等。

4 低氮胁迫抑制玉米穗粒发育的可能机制

综合上述前人的研究结果，有两个方面的问题尚不清楚:①低氮条件下叶片氮素输出及幼穗或籽粒中氮素利用，哪一个是决定幼穗与籽粒发育的关键因素?氮同化关键酶GS 的作用机制是什么?②细胞分裂素信号途径是否参与了氮素调节幼穗及籽粒的发育过程?如果是，是通过诱导叶片中氮素的输出，还是幼穗及粒中的氮素利用?是什么部位合成的细胞分裂素起到调节作用(根或穗部)?前人的研究在这两方面都提供了良好的线索，但现有实验数据还不能得出确定的结论。提出的假说是:在土壤缺氮条件下，缺氮信号通过细胞分裂素运到叶部(及其它营养器官)，诱导了叶片中氮素(蛋白质)分解、由GS 参与调控的氮素代谢以及向籽粒中的转运。转运到雌穗轴的氮素(氨基酸)一方面提供一种氮素营养信号，通过籽粒细胞分裂素的合成，传递给籽粒，控制籽粒中胚乳细胞的发育;另一方面，通过GS 酶参与调控的氮代谢过程，直接作为养分被籽粒发育所利用，见图2。氮高效利用玉米基因型可能通过细胞分裂素信号传导，使叶片蛋白质分解和(或)输出更多，增加穗/籽粒中氮素供应，并在穗部产生更强的细胞分裂素信号，诱导胚乳细胞的分裂，保证更多的籽粒正常发育结实。

图2 氮素调节玉米穗及籽粒发育的可能机理Fig.2 Possible physiological mechanism for the regulation of nitrogen availability on the development of earshoots and grains in maize

5 展 望

如何在高产的同时提高玉米氮素利用效率，是目前国际关注的热点之一。在氮素吸收的生理与分子生物学机制方面已经有较大的研究进展，而在氮高效利用方面则进展缓慢。叶片中氮素利用与转运、穗粒发育过程中氮素调节机制可能是关键的突破点。利用穗粒发育对低氮敏感性有差异的品种比较，在生理学分析的同时，通过基因芯片高能量分析技术，有可能发现一些关键的控制过程、甚至基因。其中，氮素营养与植物激素(尤其是细胞分裂素)的相互作用需要格外重视。另一方面，目前还没有发现受氮素调节的控制玉米穗粒发育的相关QTL，这一方面的工作不仅有助于深入理解氮素调节玉米幼穗及籽粒发育的遗传机制，而且还可以同时促进氮高效利用遗传改良工作。

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