食源性抗氧化肽研究进展

王 豪，苏米亚，孙克杰，徐致远，章 慧，郭本恒*

1光明乳业股份有限公司技术中心 乳业生物技术国家重点实验室，上海200436;2 上海海洋大学 食品学院，上海201306

膳食蛋白是能量和必需氨基酸的重要来源，对生长发育及生理代谢的维持必不可少。时至今日，研究者们逐渐对来源于植物或动物的生物活性肽的功能作用产生了浓厚兴趣。生物活性肽被认为是以休眠形式存在于母蛋白序列中的特异性蛋白片段，当通过酶解等方法将其释放后，可能表现出多种生理功能。这类活性肽通常由2～20 个氨基酸组成［1］，分子量小于6000Da［2］，其生物活性与氨基酸的组成序列有关［3，4］。基于活性肽的结构特性及氨基酸的组成序列，此类物质可能表现出类阿片功能［5］、促矿物质吸收功能［6］、免疫调节功能［7］、抑菌功能［8］、抗氧化功能［9］、抗血栓功能［10］、降胆固醇功能［11］或抗高血压功能［12］，甚至有几种活性肽拥有多重益生功能［1］。

本文以来源于食品中的抗氧化生物活性肽为论点，阐述了抗氧化肽的相关特征，对抗氧化活性肽的益生功效，酶法生产工艺，抗氧化能力评价方法，生物利用度及安全性进行了综合概述。

1 氧化应激

机体在有氧呼吸等正常生理代谢过程中会产生自由基，尤其在脊椎动物和人类中较为明显［13，14］。氧化反应及其次级反应除了在生理过程中产生外，还会在其它代谢途径中产生。食品加工及贮藏过程中脂肪和油脂的氧化会对产品质量造成破坏性影响，从而导致脂质含量及营养价值的损失［15］。摄入这些具有潜在毒性的食物无疑会提高疾病的发生率［14］。烟草中的污染物及氧化物也会对皮肤造成危害，甚至可能吸收至血液循环内，从而使机体的伤害加剧［16，17］。此外，紫外辐射同样会刺激机体产生大量的氧化或过氧化产物［18，19］。

生理代谢过程中产生的自由基在机体内扮演着多种功能，如信号传导、预防感染等［20-22］。然而过多的活性自由基反过来会导致人体正常的细胞组织出现损伤，引发诸如动脉粥样硬化、关节炎、糖尿病及癌症等多种疾病［23，24］。根据自由基衰老学说，机体衰老是由于自由基在细胞中逐年累积并对其造成过度氧化损伤而导致的［25］。通常而言，活性自由基会造成蛋白质损伤、DNA 突变、细胞膜磷脂氧化［26］以及低密度脂蛋白(LDL)改性［27］。

在正常环境下，抗氧化防御系统会通过活性酶(如超氧化物歧化酶及谷胱甘肽过氧化物酶)和非酶抗氧化物质(如抗氧化性维生素，痕量元素，辅酶和辅基)来清除活性自由基［21］。然而，在某些条件下，内源性防御系统并不能有效保护机体抵抗自由基的攻击，自由基的产生超越了抗氧化防御系统的清除能力，两者之间的平衡被打破，这便会导致氧化应激的产生［28］。机体若处于这种状态下会生成大量的高活性分子，诸如活性氧簇(ROS)及活性氮簇(RNS)［29］。在人体中，氧化应激通常扮演的是慢性疾病的促进作用，而不是引发作用［30］。

正因如此，合成抗氧化剂及天然抗氧化剂显得尤为重要，这些抗氧化剂能预防氧化应激的发生并减缓由其引发的氧化损伤。合成抗氧化剂性价比较高、效果突出，但会表现出某些毒性及危害效应［31］。就人体营养及生理生化特性而言，食源性的天然抗氧化剂由于具有潜在的益生作用且无任何毒副作用，近年来已成为研究者们关注的焦点。同时，与合成抗氧化剂相比，民众们更倾向于选择天然抗氧化剂。

合成抗氧化剂与天然抗氧化剂相比，其抗氧化效果更为显著。例如大豆水解物的自由基半数清除率(IC50)就要高于Trolox(水溶性维生素E)或维生素C［32］，但只要提高天然抗氧化剂的使用剂量，仍会达到等效的抗氧化效果。

2 食物蛋白中的抗氧化肽

自Marcuse 首次报道了活性肽的抗氧化作用后［33］，该类物质的生物活性便被广泛研究，已有大量研究发现来源于蛋白成分的几种多肽或寡肽具有抗氧化能力。抗氧化肽含有5～16 个氨基酸残基［34］，食源性抗氧化肽被认为是既安全又健康的物质，它具有低分子量、低成本、高活性、易吸收等特点。与抗氧化酶类相比，抗氧化肽的优势在于其结构简单，在不同环境条件下其稳定性更高，无任何免疫毒性作用，而且除抗氧化活性外，还兼具营养功能及其它功能性质［35，36］。在益生功能的研究中，蛋白水解产物和生物活性肽是两个不同的研究对象。蛋白水解产物是一类主要由肽及氨基酸所组成的混合物，可采用酶法、酸碱处理或微生物发酵等方式获得，若蛋白质水解是经内源性蛋白酶所诱导的，则定义其为自溶产物而非水解产物，而生物活性肽是指从蛋白水解产物中纯化出的、以肽键相连的几种氨基酸所组成的化合物。

Vioque 等根据水解度(DH)的不同将蛋白水解产物划分为三个主要类别［37］，分别是(1)具有低水解度和改良功能特性的水解产物;(2)具有多种水解度的水解产物(通常作为风味物质使用);(3)具有广谱水解度的水解产物(多用于营养强化剂及特殊膳食食品)。

糖及氨基酸的存在会促进机体对寡肽的吸收，因此未经纯化的蛋白水解产物较纯化肽在营养学应用方面具有更为明显的优势［38］。而且，蛋白水解产物还表现出比纯化肽更高的抗氧化能力［39］。

不同来源的抗氧化蛋白水解产物及活性肽的研究主要涉及花生仁［40］、米糠［41］、葵花蛋白［42］、苜蓿叶蛋白［36］、玉米麸质［43］、红薯［44］、卵黄蛋白［45］、开菲尔发酵乳［46］、药用真菌［47］、鲭鱼［48］、咖喱叶［49］、棉树叶虫［50］、酪蛋白［51］、水藻蛋白［52］及荞麦蛋白［53］等动物或植物。表1 列出了活性肽及蛋白水解产物的抗氧化活性及结构特征研究。

虽然活性肽发挥抗氧化作用的确切机制至今仍还没得到充分阐明，但研究显示活性肽可作为脂质过氧化的抑制剂［48，54，55］、自由基的清除剂［15，54，55］和过渡金属离子的螯合剂［15］。此外，抗氧化肽还可保护细胞免受基因诱导型ROS 所引发的氧化损伤。有研究发现，从沙丁鱼肌肉中提取出的二肽(蛋氨酸-酪氨酸)可通过刺激内皮细胞中血红素加氧酶-1(HO-1)及铁蛋白(抗氧化防御蛋白)的表达从而阻止氧化应激的发生［56］。另有体内实验指出，叶蛋白可促进谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及超氧化物歧化酶(SOD)的活性，并降低丙二醛(MDA)含量［57］。

活性肽的抗氧化特性与其本身组成、结构及疏水性密切相关［3］。酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、半胱氨酸及组氨酸是抗氧化肽中常见的氨基酸残基［58］。携带芳香基团的氨基酸往往会向缺电子自由基提供质子，这一特性促进了此类氨基酸残基的自由基清除能力［15］。研究显示，含组氨酸的活性肽抗氧化活性与咪唑基的质子供给能力、脂质过氧化自由基诱捕能力及金属离子螯合能力有关［15，59］。此外，半胱氨酸中的巯基作为起决定作用的功能基团，可与自由基直接反应从而表现出抗氧化能力［55］。

除含有的特定氨基酸外，氨基酸排列顺序对活性肽发挥抗氧化能力同样至关重要［15］。Chen 等［39］根据一种大豆蛋白(伴大豆球蛋白)水解后获得的抗氧化肽的结构(Leu-Leu-Pro-His-His)设计了28 种合成肽，研究显示其抗氧化活性主要取决于Leu-Leu-Pro-His-His 主链上的His-His 片段，从C 端移除His 残基后其抗氧化活性显著下降。在所有评测的合成肽中，Pro-His-His 氨基酸序列的寡肽显示出最强的抗氧化能力。Saito 等［60］分析指出，三肽中氨基酸序列排布的改变会对抗氧化活性造成影响，表2列出了活性肽中氨基酸的特征组成及其抗氧化活性的可能作用机理。

表1 不同来源的抗氧化肽Table 1 Antioxidant peptides derived from various sources

表2 抗氧化肽的氨基酸组成及作用机制Table 2 Amino acid compositions and action mechanism of antioxidant peptides

活性肽中氨基酸的链接及肽本身的结构特征会影响其抗氧化能力。有研究显示，当将某些特定的氨基酸组合至二肽中后，其会表现出更强的抗氧化活性［66］。与此类现象相反的是，其它一些研究结果指出，肽键或肽结构的改变会降低组成氨基酸的抗氧化活性。因此，活性肽的组成结构是一把双刃剑，就其抗氧化活性而言，其结构的改变既可产生协同促进作用，也会产生排斥拮抗作用［67］。

此外，活性肽的空间构象同样会对其抗氧化活性产生影响。Chen 等［34］发现抗氧化肽中L 型组氨酸为D 型组氨酸所取代后，其抗氧化性能出现下降。他们认为咪唑基在整个构象中所处的位置是影响活性肽抗氧化能力的关键要素。

除上述所提到的几点外，还有其它条件也会对活性肽的抗氧化能力产生影响。如蛋白质的分离操作条件，水解度的强弱，蛋白酶的种类［68，69］，活性肽浓度等同样会影响肽的抗氧化及其生物活性。在研究花生蛋白水解物时发现，蛋白质浓度会对其抗氧化活性造成影响［63］。此外，肽的分子量大小也有可能决定其抗氧化能力的强弱。研究发现玉米麸质水解物的抗氧化活性与其反应浓度及分子量相关，分子量在500～1500 Da 范围内的肽的抗氧化能力要强于分子量大于1500 Da 或小于500 Da 的抗氧化肽［43］。然而，活性肽的总体抗氧化能力应归因于上述影响因子的综合作用，而并非某个因素的单独作用［3］。

2.1 抗氧化肽的益生作用

正如前文所提到的，自由基对机体组织的攻击会引发某些退行性疾病并加速其病理反应进程。最近的研究显示，氧化应激可能会增强胰岛素的耐受性或削弱胰岛素的分泌，从而导致Ⅱ型糖尿病的发生。若自由基的过量产生无法受到约束，则会加剧糖尿病及其并发症的恶化［21］。另有研究指出，在代谢综合症患者中，氧化应激对心血管并发症(如动脉粥样硬化及脂质代谢异常等)的引发和进一步发展起着关键作用［70］。

基于氧化应激与疾病之间的密切关系，控制氧化应激应是降低疾病发生率或预防相关并发症的重要手段。因此，目前已有大量控制氧化应激的抗氧化剂从天然资源中分离并鉴定出来。除了诸如维生素C、多酚、类黄酮、类胡萝卜素等已知的天然抗氧化剂外，抗氧化肽成为近年来研究的新焦点。有研究证实，小鼠摄入豆豉提取物后可有效增强其肝脏及肾脏中SOD、过氧化氢酶(CAT)及GSH-Px 的活性，而血清中硫代巴比妥酸反应产物(TBARS:涵盖了大部分氧化伤害产生的醛酮类物质)的含量则明显降低，这些益生效果应归因于豆豉提取物中所含的抗氧化活性肽及游离氨基酸组分［71］。另有研究发现，当自发性高血压大鼠(SHR)摄入卵清水解物后(0.5 g/kg/d)后，其血浆中自由基清除能力得以提高，主动脉中高浓度的MDA 出现降低。该研究推测，卵清水解物可能是通过抑制脂质的过氧化来增加血浆的自由基清除能力，从而有效预防氧化应激［72］。Pena-Ramos 和Xiong 报道称大豆蛋白分离物及水解物均可下调28%～65%的TBARS［69］，另一项研究指出雄性Wistar 大鼠摄取大豆蛋白分离物或大豆多肽后，百草枯(PQ)诱导型氧化应激出现显著下降，服食氨基酸混合物却不会有此效果。此外，大豆蛋白分离物和大豆多肽还可有效阻止血清中TBARS 含量的升高［73］。开菲尔发酵豆乳除了表现出抗氧化活性外，还表现出显著的抗突变活性，可开发成预防突变或氧化损伤的保健食品［46］。

2.2 生物活性肽的酶法生产工艺

生物活性肽可通过多种方法从前体蛋白中制备，主要包括酶水解(消化酶或来源于微生物及植物中的酶)和微生物发酵［74］。在东南亚国家如中国、韩国、日本，发酵是用于生产及保存食品的一种传统方法，发酵除了会增加食品的营养保健价值，还会在一定程度上延长食品的保质期，这可能是由于微生物蛋白酶作用蛋白片段后产生的生物活性肽发挥了功能作用［15］。

酶水解工艺广泛用于升级蛋白质的功能特性及营养价值［64，75，76］。如水解β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白后其抗氧化活性出现明显增强［60］，这是由于水解反应会促使更多的活性氨基酸R 基团暴露出来，从而提高了其抗氧化活性［77］。有报道指出水解还会产生其它作用，如水解可展开折叠的蛋白质链，凸显原本位于蛋白质内部的疏水基团，导致疏水性能增强。此外水解作用还可降低体系中的过敏原成分［64］。然而，肽键的断裂也会增强促溶性游离氨基及羧基基团的产生水平。因此水解可能增强，也可能降低疏水性，这取决于前体蛋白的类型及所产生的肽的分子量［75］。此外，水解会产生小分子生物活性肽［64，78］，其中分子量低于1000 Da 的活性肽的苦味要远弱于大分子肽，但过度水解会对肽的功能性造成不利影响［78］。

尽管苜宿叶蛋白有较高的营养价值，但由于其难溶于水，且色泽、口味及质构的感官评价较差［79］，因此应用十分有限，而利用酶水解方法能够消除此类应用壁垒［36］。

蛋白酶特异性会影响所形成的活性肽大小、产生量、组成和氨基酸序列，从而影响水解产物的抗氧化活 性［39，48，80］。在Pena-Ramos 和Xiong 的 研 究中［69］，他们采用不同的酶水解天然或热处理的大豆分离蛋白，不同的酶水解形成不同组成、不同水解度的肽混合物，其抗氧化范围有所差异。

在各类研究中发现，碱性蛋白酶水解物的抗氧化活性普遍要高于其它水解产物［55，81］，且除抗氧化功能外还具有其它不同的生物活性［81］。与其它蛋白酶相比，碱性蛋白酶可催化生成更多的抗氧化肽且分子量更小，产生的活性肽还具有较强的消化酶耐受性［81，82］。

2.3 抗氧化活性评价方法

考虑到氧化应激对机体的危害性及抗氧化剂的预防作用，越来越多的研究者们开始关注食品的抗氧化功效。目前已建立了几种抗氧化评价模型，有助于测定食物中抗氧化物质的含量、评估食物对氧化作用的耐受能力及食物经消化后所表现出的抗氧化活性［83，84］。根据化学反应的不同，抗氧化分析方法分为两类:一类是参照氢原子迁移(HAT)制定的方法，另一类是参照电子迁移(ET)制定的方法［83］。基于HAT 机制的分析方法主要适用于竞争性反应，即抗氧化剂和底物竞争与热反应所产生的过氧化自由基结合，如氧自由基吸收能力(ORAC)测定、总自由基清除抗氧化能力(TRAP)测定和β-胡萝卜素漂白实验。基于ET 机制的分析方法则是测定抗氧化剂的还原能力，体系中氧化剂作为监视反应进程的探针并指示反应终点［85］，如总抗氧化能力(TEAC)测定，铁离子还原能力(FRAP)测定及二苯代苦味肼自由基清除能力(DPPH)测定等方法常用于分析活性肽的抗氧化能力。其反应流程及电子迁移为:探针(氧化剂)+e(来自于抗氧化剂)→还原型探针+被氧化的抗氧化剂［87］。

由于HAT 涉及到自由基链式反应中的关键步骤，因此采用基于HAT 的抗氧化评价模型所测得的抗氧化活性很大程度上与阻断自由基的链式反应有关［86，87］。然而，活性物质的还原能力也是一种重要的化学指标，基于ET 的分析方法可体现出与此相关的抗氧化能力。例如，某些抗氧化剂可通过还原能力，将水溶性氧化剂如过氧化亚硝基阴离子及次氯酸盐降解为无害产物［83］。

除上述所提到的检测方法外，还有其它的方法用以评价ROS 及RNS，包括超氧阴离子清除能力测定、过氧化氢清除能力测定、羟自由基清除能力测定、单线态氧清除能力测定及过氧亚硝基阴离子清除能力测定等。

需要指出的是，体外实验测得的抗氧化活性可能与体内环境下所得到的结果无直接相关性，这是因为体外实验无法将相关物质在体内的生物利用度、反应效率、稳定性和在机体组织内的贮藏性等参数纳入体外模型的评价中，而且体外模型与真实的生物系统几乎无相似性。因此，体内实验数据需与体外抗氧化结果相关联，方可明确其抗氧化功效［83，87］。脂质、蛋白质的过氧化反应及DNA 损伤等可作为生物标记，用以评定体内氧化应激所导致的氧化损伤［88］。

虽然目前已有较多的食品抗氧化能力评价方法，但还没有任何一种被指定为官方的检测标准。因此，有建议指出可根据不同氧化条件下不同的检测方法来建立相应的评价标准［89］。

2.4 活性肽的生物利用度

虽然有大量的证据证明了生物活性肽的体外抗氧化作用，但更为重要且困难的是探究活性肽的体外抗氧化作用和体内抗氧化功能之间的相关性。活性肽在肠道、血管和肝脏内易被降解与修饰。因此，生物肽需克服此类障碍方能以活性形式到达体内特定靶组织，发挥抗氧化功能。

研究发现有小部分活性肽可顺利越过肠道屏障，虽然由于分子量太小而不具备高营养值，但可表现出组织水平上的生物效应［90，91］。活性肽的完整吸收是一种自然生理过程，不同于常规的肽转运途径［90］。表3 列出了活性肽完整吸收的几种途径，包括细胞旁路途径、跨细胞扩散，载体调节运输、胞吞作用和淋巴系统。

表3 活性肽完整吸收的几种途径Table 3 Several routes of intact absorption of active peptides.

某些活性肽可通过胞间隙进入肠道淋巴系统，以完整的形式为机体所吸收。然而，门静脉循环中毛细血管的渗透性及活性肽本身的脂溶性会对其进入肠道淋巴系统产生影响［94］。有报道指出经胃肠道淋巴系统转运的药物可免遭肝脏的代谢作用［96］。

分子大小和结构特性(如疏水性等)会影响活性肽的转运途径［97］。研究显示，与蛋白质和游离氨基酸相比，含有2-6 个氨基酸残基的肽更容易被人体所吸收［98］。Roberts 等［99］报道了小分子肽(二肽和三肽)及大分子肽(10～51 个氨基酸)可完整穿越肠道屏障而不被肠道酶系分解，并表现出组织水平上的生物学功能。然而，随着肽分子量的增大，其通过肠道屏障的机会也随之降低。有研究显示含有脯氨酸及羟脯氨酸的肽可抵抗消化酶的作用，尤其是C 端带有Pro-Pro 的三肽可耐受脯氨酸特异性肽酶［100］。

此外，在一项研究中观察到，活性肽在人体血浆中具有明显的剂量效应，而转运载体的饱和度可能会影响进入外周血循环中的活性肽数量［101］。

活性肽经口服摄入后，由于其在体内的生物利用度较低，因此在体外具有抗氧化活性的生物肽可能在体内表现出很低的活性，甚至无抗氧化活性检出。然而，其它可提高肽吸收效率的旁路途径能在一定程度上减弱上述影响，反而有可能出现体内抗氧化活性高于体外抗氧化活性的现象。在一些研究中指出，生物活性肽发挥抗氧化功效可能并不仅仅是通过在实验中所发现的作用机制［102］。此外，有研究表明体内抗氧化活性的增强还可能是由于活性肽经胃肠道酶系水解后，生成了更高活性的抗氧化肽所致［103］。

2.5 生物活性肽的安全性

生物活性肽在开发成产品之前必须经过严格的安全性评价，但很少有研究分析食源性生物活性肽对人体健康的有害影响，即便目前已有研究报道了肽的细胞毒性作用。有趣的是，研究者们认为活性肽的这一特性反而有助于其杀灭癌细胞，具有潜在的抗癌能力［104］。大部分来源于食物及花粉的过敏原均是以蛋白质为基质的，蛋白质经水解后可降解为低分子的生物活性肽，从而减少过敏症状的发生［64］。然而，某些活性肽仍可能保留其母蛋白的一部分致敏特性［104］，同样会诱发严重的过敏反应，如在一项花生过敏原(命名为Arah1)的研究中发现，该过敏原可被胃十二指肠消化裂解为小分子肽，但该小肽仍具有母蛋白的致敏能力［105］。

生物活性肽产生于大量人类所长期摄入的食品来源中，对人体的不利作用几乎为零。然而由于活性肽可能具备细胞毒性作用，因此仍需对活性肽的安全性展开评估。

3 小结与展望

生物活性肽作为膳食中的重要组成部分，人们对其的认识还较为有限，而色谱法是目前用于分析生物活性肽的主要手段。活性肽除表现出营养作用外，还具有益生调节功能，可作为功能食品、保健食品及膳食补充剂的基础成分。此外，活性肽还可应用于医药领域，相关的商业化产品已在日本等国市场中销售。

生物活性肽可表现出比前体蛋白更高的活性，但是活性肽可能会与其它食品成分(碳水化合物、脂类等)相互作用［106］，这一过程可能形成致敏性成分或毒性物质，因此有必要对含有生物活性肽的食品的安全性作出相应评价。此外，需大力发展现代化技术从食品蛋白中富集活性肽，工业化大量生产此类功能物质以满足市场需求。在生物活性肽的益生作用研究方面，很少有相关的人体临床实验，因此进一步的研究应着重于阐明活性肽在人体中发挥的生理功能机制。

在食源性活性肽研究领域中，植物来源的生物肽可能是个更好的选择，这归因于其富含与抗氧化功能相关的药用及生物活性成分［44］。芳香类植物和草本类植物由于含有电子供体，可终止自由基链式反应，从而抑制食品中脂肪的氧化哈败，避免哈喇味等腐臭味的产生，提高消费者对食品的接受度［49，107］。根据FAO 报告，植物叶蛋白被认为是一种有利于机体消化的高质量蛋白，具有纯天然、高营养附加值及降胆固醇等功能特点［79］。此外，含有植物源性生物活性肽的食物还可满足素食者的需求。因此，与动物来源相比，植物来源的蛋白水解产物或生物活性肽具有更高的研发价值，可在今后大力挖掘。

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