归芪多糖延缓衰老作用的研究

蒲秀瑛 ，李 言，张伟杰，王恒瑞，王 鹏

兰州理工大学 生命科学与工程学院，兰州730050

当归为伞形科植物当归 (Angelica sinensis(Oliv.)Diels )的干燥根，是临床常用药，一般认为其味辛，而性微温，归心、肝、脾三经。现代药理学研究进一步证明了当归活血化瘀、补血止痛等作用，同时还发现，当归有抗炎、清除氧自由基、保肝利胆、保护肾脏、增强免疫功能等作用［1，2］。黄芪是豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.Var.mongholicus(Bge.)Hsiao 或膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge. 的干燥的根，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌之功能［3］。多糖(polysaccharide)是一类具有广泛生物活性的生物大分子物质，存在于近百种植物中，由于其生理活性强，细胞毒性低，毒副作用小，因此对植物多糖的研究已成为医药界的热门领域［4］。

目前对各种中草药中提取的多糖的药理研究较多，当归和黄芪又是最常见的传统中药，且当归多糖与黄芪多糖分别为其重要活性化合物。本课题组研究表明，从一定比例的当归和黄芪中提取的归芪多糖具有一定的抗氧化和保护肝损伤等作用［5，6］。本试验通过建立衰老小鼠模型，观察归芪多糖的延缓衰老作用及其作用机制，为开发抗衰老天然药物提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 药材

当归，黄芪:均购自甘肃岷县。药材样品分别经甘肃省药品检验所鉴定为当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels 和膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥的根。

1.2 实验动物

昆明种SPF 级小鼠50 只，2 月龄，体重(30 ±5)g，雌雄各半，由兰州大学动物实验中心提供。动物许可证号:SCXK(甘)2009-0004。

1.3 主要试剂和仪器

RE-5286A 型旋转蒸发仪(上海雅荣生化设备仪器有限公司);ULTRA-TURRAX 378 型组织匀浆机(东莞市通用精工液压机械工具厂);紫外分光光度计(南京麒麟分析仪器有限公司);MK3 型酶标仪(成都一科仪器设备有限公司)。乙醇、丙酮、氯仿、正丁醇(均为分析纯)。维生素E 胶丸购于厦门星鲨制药有限公司(批号091110)，D-半乳糖购于sigma 公司。过氧化氢测定(H2O2)试剂盒，批号:20100809;蛋白质测定(考马斯亮蓝法)试剂盒，批号:20100725;谷胱甘肽过氧化物酶测定(GSH-PX)试剂盒，批号:20100728;黄嘌呤氧化酶(XOD)测定试剂盒，批号:20100809;羟脯氨酸(Hyp)测定试剂盒，批号:20100825 和单胺氧化酶(MAO)测定试剂盒，批号:20100809;均购于南京建成生物工程研究所。

1.4 归芪多糖的制备

将当归与黄芪的混合物(1∶5)以10 倍量(体积质量比)80%的乙醇回流提取2 次，每次2h;过滤得归芪粗粉。归芪粗粉中加入一定量的蒸馏水，加热回流提取2 次，每次2 h，合并滤液，然后加适量95%乙醇，使乙醇终浓度为80%，过夜，抽滤，得归芪多糖浸膏。用sevag 法除蛋白，在浸膏中加入正丁醇、氯仿混合溶液(正丁醇∶氯仿= 1∶5)，剧烈振摇20 min，离心，除去下层与交界处的变性蛋白，重复3～5 次;收集上层多糖溶液，减压浓缩去除有机溶剂并得到归芪多糖，测得其多糖含量为53.8%。

1.5 实验动物分组及给药

将小鼠随机分为5 组，每组10 只，雌雄各半，分别为正常对照组、衰老模型组、VitE 组、归芪多糖高剂量组(1g/kg)、归芪多糖低剂量组(0.5 g/kg)。除正常对照组外，其余各组每日颈背部皮下注射D-半乳糖(0.5 g/kg)，1 次/d，正常对照组注射同剂量的生理盐水。从第8d 开始，归芪多糖高、低剂量组分别以1 和0.5 g · kg-1/d 的剂量灌胃，0.2 mL/次，1次/d，维生素E 组灌服0.1 g · kg-1/d 的维生素E溶液，0.2 mL/次，1 次/d，共计42 d。每日用剃毛器剃去所有小鼠背部被毛，暴露约2 cm×2 cm 的皮肤，归芪多糖高剂量组(1 g/kg)和低剂量组(0.5 g/kg)分别以含30%甘油的归芪多糖提取液擦拭背部皮肤，早晚各一次，共计42 d;其余各组以生理盐水对背部皮肤进行擦拭。

1.6 归芪多糖对衰老小鼠血清中H2O2、肝组织中GSH-PX 和XOD 的测定

42 d 后，摘眼球取血后脱颈处死小鼠，分离血清，参照试剂盒说明书测定H2O2含量;同时摘取小鼠肝组织，低温匀浆后加生理盐水［肝重(g)/生理盐水(mL)=1/9］，离心(4 ℃，2500 rpm ×30 min)后取上清，参照试剂盒说明书测定GSH-PX 和XOD的活力。

1.7 归芪多糖对衰老小鼠脑组织中MAO 和皮肤羟脯氨酸含量的测定

取小鼠脑组织制成10%的组织匀浆，离心(4℃，2500 rpm)30 min 后取上清，参照试剂盒说明书测定MAO 活力;再分别取各组小鼠背部给药部位皮肤，去毛及脂肪，用1∶1 丙酮-乙醚脱脂，切碎晾干，精密称取20 mg，参照试剂盒说明书进行Hyp 含量的测定。

1.8 统计学处理

2 结果与分析

2.1 归芪多糖对衰老小鼠血清H2O2、肝组织GSHPX 活力和XOD 活力的影响

模型对照组与正常组相比，血清H2O2含量和肝组织XOD 活性明显升高，GSH-PX 活性降低，说明D-半乳糖致衰老小鼠模型造模成功，如表1 所示。

维生素E 和归芪多糖均能降低衰老小鼠血清H2O2含量和肝组织XOD，活力差异极显著(P ＜0.01)。且维生素E 与高低剂量归芪多糖相比，无显著性差异，提示高剂量归芪多糖降低衰老小鼠血清H2O2含量和肝组织XOD 的作用与阳性对照药物维生素E 的作用类似;而低剂量组H2O2含量和XOD的活力均低于维生素E 组的(P ＜0.05)，说明归芪多糖浓度越高，衰老模型小鼠血清H2O2含量和肝组织XOD 活力越低，抗衰老作用可能越强。

相比正常组，模型对照组肝组织GSH-PX 活性明显降低，而经维生素E 和归芪多糖治疗后GSHPX 活性明显得到提高(P ＜0.01)，表明归芪多糖可显著提高衰老小鼠肝组织GSH-PX 的活性，且归芪多糖高剂量组GSH-PX 活性与维生素E 组差异不显著。

表1 归芪多糖对衰老小鼠血清H2O2、肝组织GSH-PX 和XOD 活力的影响(±s，n=10)Table 1 Effect of Guiqi Polysaccharides on H2O2of serum，GSH-PX and XOD of liver tissue in aging mice(±s，n=10)

表1 归芪多糖对衰老小鼠血清H2O2、肝组织GSH-PX 和XOD 活力的影响(±s，n=10)Table 1 Effect of Guiqi Polysaccharides on H2O2of serum，GSH-PX and XOD of liver tissue in aging mice(±s，n=10)

与衰老模型组相比:★P ＜0.05;★★P ＜0.01;与VitE 组相比:▲P ＜0.05;▲▲P ＜0.01Note:★P ＜0.05;★★P ＜0.01vs Aging Model;▲P ＜0.05;▲▲P ＜0.01 vs Vitamin E

组别Group H2O2 含量H2O2content(mmol·L-1)XOD 活力XOD activity(U· mgprot-1)GSH-PX 活力GSH-PX activity(U· mgprot-1·min)正常对照组Normal 127.73 ±11.94★★ 18.65 ±3.17★★ 160.94 ±12.97★★衰老模型组Aging Model 199.12 ±21.3 26.94 ±2.24 77.59 ±6.68维生素E 组Vitamin E 144.51 ±12.15★★ 21.11 ±1.95★★ 153.24 ±11.16★★归芪多糖高剂量组Higher dose 148.04 ±15.01★★ 20.99 ±1.46★★ 142.11 ±10.30★★归芪多糖低剂量组Lower dose 171.38 ± 17.16★▲ 22.20 ±3.07★ 91.99 ±7.92★★▲▲

2.2 归芪多糖对衰老小鼠大脑MAO 和皮肤中Hyp含量的影响

研究结果显示(见表2):衰老模型组小鼠脑组织中MAO 水平较正常对照组高，两者间差异极显著(P ＜0.01)。衰老模型小鼠经归芪多糖干预后，脑组织MAO 的活力有所降低(P ＜0.05;P ＜0.01)，说明归芪多糖可明显降低衰老小鼠脑中MAO 的活力，并且随多糖含量增高，效果愈加明显。

同时显示，归芪多糖可显著拮抗D-半乳糖的作用，不同剂量组(0.5 和1 g/kg)均能使皮肤组织中羟脯氨酸含量明显回升(与模型组相比较)，且高剂量组略高于低剂量组，提示归芪多糖提取物在改善小鼠皮肤胶原蛋白代谢、恢复衰老小鼠皮肤弹性方面具有一定的作用，且在本实验剂量范围内，药物浓度越高，对小鼠皮肤抗衰老的作用可能越强。

表2 归芪多糖对衰老小鼠脑中MAO 和皮肤中Hyp 含量的影响(±s，n=10)Table 2 Effects of Guiqi Polysaccharides on the brain MAO and the skin Hyp of the aging mice(±s，n=10)

表2 归芪多糖对衰老小鼠脑中MAO 和皮肤中Hyp 含量的影响(±s，n=10)Table 2 Effects of Guiqi Polysaccharides on the brain MAO and the skin Hyp of the aging mice(±s，n=10)

与衰老模型组相比:★P ＜0.05;★★P ＜0.01;与VitE 组相比:▲P ＜0.05;Note:★P ＜0.05;★★P ＜0.01vs Aging Model;▲P ＜0.05;▲P ＜0.05 vs Vitamin E

组别Group Hyp 含量Hyp content(ug · mg-1)MAO 活力MAO activity(U· mgprot-1)正常对照组Normal 1.67 ±0.28★★ 9.23 ±0.64★★衰老模型组Aging Model 1.24 ±0.16 11.12 ±0.95维生素E 组Vitamin E 1.54 ±0.18★★ 9.51 ±0.71★★归芪多糖高剂量组Higher dose1.47 ±0.19★★ 9.85 ±0.77★★归芪多糖低剂量组Lower dose1.33 ±0.15★▲ 10.38 ± 0.85★▲

3 讨论

本实验通过D-半乳糖建立衰老小鼠模型，使小鼠全身代谢紊乱，脂质过氧化亢进，蛋白质合成减少，造成神经细胞结构改变和功能退化，另外，该模型动物的多种组织细胞的病理变化也符合自然衰老时所出现的病理改变，说明本实验动物模型具有一定的可靠性，故可用于抗衰老药物研究。

维生素E 可保护多价的不饱和脂肪酸免受氧化破坏，预防和阻止诱发脂质的过氧化，减少过氧化脂质的生成，维持生物膜的正常结构［7］。是公认的具有抗衰老作用的一种抗氧化剂，因此，以维生素E 作为对照药物来比较归芪多糖的抗衰老作用。

自由基学说［8，9］认为自由基能引起细胞发生不可逆的损坏，导致细胞脆性增加、细胞断裂、肌肉萎缩、记忆下降、智力减退，加速老化和衰老。从而增加有机体病变和死亡的可能性。因此，可以通过抑制或减少有机体组织中自由基的浓度而延长有机体的寿命。

本研究结果显示:模型对照组小鼠血清中H2O2显著上升，提示H2O2的大量堆积使H2O2攻击机体内的生命大分子物质及各种细胞器，加速机体的衰老进程，可能是小鼠衰老的原因之一，而归芪多糖可明显降低D-半乳糖致衰老小鼠血清中H2O2含量，可能的原因是归芪多糖提升了衰老小鼠血清中CAT(catalase，过氧化氢酶)的活力，CAT 清除自由基和H2O2，使H2O2含量降低，减少自由基对机体的损害。

GSH-PX 是有机体内一个能够帮助清除自由基的酶，人体随着年龄的增长，血清和组织中的GSHPX 的活性会下降［10］。而XOD 是体内核酸代谢中一种重要的酶，当组织缺血缺氧时，XOD 活性会大大提高并催化黄嘌呤氧化反应，产生大量的自由基，还可通过直接损伤血管内皮细胞、激活产生氧化作用的炎症细胞，对器官的氧化损伤和在相对防御功能薄弱的地方产生活性氧等直接造成组织损伤。

归芪多糖作用于衰老小鼠后，其肝组织中GSHPX 的活性明显升高，而XOD 的活性显著减弱(P ＜0.01)，提示归芪多糖可能通过提高小鼠肝组织中GSH-PX 的活性和降低XOD 的活性增强了机体清除自由基的能力，保证细胞膜结构和功能的完整，延缓细胞凋亡的发生，从而起到一定的抗衰老作用。

单胺氧化酶(MAO)与衰老也是密切相关的，在正常肝、肾、大脑、脑于等区活动性较强，可催化单胺氧化脱氨基，参与神经元去甲肾上腺素、5-羟色胺等递质的分解［11］。

哺乳动物及人类皮肤的老化与胶原蛋白有着密切关系，而胶原蛋白组成中羟脯氨酸占12 %～14%，含量高且稳定的羟脯氨酸成分是胶原蛋白的一大特点，因此可通过定量测定皮肤中胶原蛋白含量或直接测定羟脯氨酸含量作为皮肤衰老程度的指标。

本研究显示，不同剂量的归芪多糖(0.5 和1 g/kg)可明显抑制D-半乳糖致衰老小鼠脑组织中MAO 活性的升高(P ＜0.01)，而MAO 活性下降有利于保持神经系统的正常功能，对机体的抗氧化及抗衰老有促进作用。且能提高D-Gal 致衰老小鼠皮肤中的Hyp 含量(P ＜0.05，p ＜0.01)，减缓皮肤皱缩、松弛，提示其可能促进胶原蛋白合成，起到抗皮肤衰老的功效。

4 结论

本实验采用人工复制催老动物模型的方法建立衰老小鼠，使衰老小鼠组织在功能上发生变化，再通过灌服不同剂量的归芪多糖来研究归芪多糖的抗衰老作用及机制。结果发现:归芪多糖通过降低小鼠血清H2O2含量，抑制脑组织MAO 和肝组织XOD活性，提高肝组织GSH-PX 活力及皮肤Hyp 的含量，来增强机体对自由基损伤细胞膜结构的保护能力，减轻自由基对生物大分子的攻击，从而起到抗氧化和抗衰老的作用，这为进一步研究抗衰老的药物提供了有力的实验依据。

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