蓝莓提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用研究

沈 潇，孙晓红* ，赵 勇，谢庆超，吴启华，潘迎捷

1上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海201306;2 美国缅因大学食品科学与人类营养系，缅因04469

蓝莓又称越橘、蓝浆果，是一种极耐寒的野生植物。其果实不仅肉质细腻、酸甜适中，而且营养丰富，因此被誉为“浆果之王”。果实中最具吸引力的营养成分当数其中含量丰富的酚类物质，研究表明，蓝莓中的酚类物质具有抑菌、抗炎［1］、抗癌［2］等活性，而且在相应的抑制浓度下不影响动物体细胞的正常生长［3］。有报道指出，蓝莓中的酚类物质能显著降低菌体细胞对肠道上皮组织的粘附性［4］。陈玉峰等研究表明蓝莓能抑制大肠杆菌的生长，且抑菌效果随色素浓度的增加而增强［5］。

金黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒的重要致病菌之一，主要通过食品传播。据美国疾病预防控制中心的统计，金黄色葡萄球菌在引起食物中毒的病原菌中占第2 位［6］。相关报道显示［7］，2003～2007 年深圳市南山区274 起细菌性食物中毒事件中，由金黄色葡萄球菌所引起的食物中毒事件比率为14.2%。抗生素是治疗金黄色葡萄球菌感染的常见方法，但此方法使金黄色葡萄球菌的耐药性增长迅速，大部分抗生素已难以抑制其生长［8］。

植物体内富含生物活性化合物，其中大多数化学物质具有抑菌活性。而天然的抑菌剂相对于合成的化合物来说更加安全和健康，所以现在很多天然产物被广泛关注，并用来预防和治疗由细菌引起的各种疾病［9］。本研究选取四种在我国栽培时间长、遗传性状稳定且产量高的蓝莓代表种为原料，研究其对金黄色葡萄球菌的抑制效果，为今后蓝莓抑菌活性物质的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

蓝莓:Elliott、Darrow、Bluecrop 和Duke 均由青岛沃林农业公司提供，四种蓝莓属北高丛蓝莓(Highbush Blueberry)。金黄色葡萄球菌(AB91093)购自上海疾病预防与控制中心。没食子酸、无水乙醇，乙酸乙酯，盐酸均购于国药集团药业股份有限公司。ODS-A C18 填料购于北京金欧亚科技有限公司。胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)，胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)购于北京陆桥技术有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 蓝莓提取物的制备

取四个品种的冷冻蓝莓，进行微波加热并快速解冻，洗净原料，使用均质机充分搅碎，称取20.0 g蓝莓浆置于200 mL 75%乙醇中，于室温超声粉碎30 min，过滤，滤液于4000 rpm 离心20 min，取上清液于50 ℃旋转蒸发仪旋转蒸发，待乙醇挥发完全后，将上清液浓缩至2 g/mL，总体积为10 mL，置于-20 ℃保存备用。

1.2.2 蓝莓对金黄色葡萄球菌的抑菌活性测定

将四种蓝莓提取物分别用灭菌胰蛋白胨肉汤(TSB)配制为以下浓度:900，450，225，112. 5 mg/mL，每支试管总体积为2 mL，取10 μL 5 logCFU/mL金黄色葡萄球菌菌液依次接入相应浓度的蓝莓提取物中。同时，根据FDA 的相关标准［10］，将山梨酸钾用无菌TSB 稀释至2 mL，使其最终浓度为2 mg/mL。取10 μL 含有约5logCFU/mL 的金黄色葡萄球菌菌液接入试管中。用1 mL 的无菌水代替蓝莓提取液作为对照组，操作同上，37 ℃培养24 h，用平板计数法进行计数。

1.2.3 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定

将四种蓝莓提取物与山梨酸钾用灭菌TSB 分别配制2 mL 的浓度为:100，200，300，350，400，600，800 和1080 mg/mL 的溶液，分别接入10 μL 含有5logCFU/mL 的金黄色葡萄球菌。对照组取1 mL 无菌水代替蓝莓提取物加入1 mL TSB 中，加入10 μL含有约5logCFU/mL 菌液并于37 ℃培养24 h，用平板计数法进行计数。

1.2.4 蓝莓中总酚含量的测定

采用Folin-Ciocalteu 法测定蓝莓中总酚酸含量［11］。准确吸取0.1 mL 样品液于100 mL 容量瓶中，加50 mL 蒸馏水，再加入4 mL Folin-Ciocalteu 试剂摇匀，静置5 min，加入8 mL 10% Na2CO3，蒸馏水定容，置于25 ℃的恒温水浴锅中2 h，显色后于最大波长下测定吸光度，由标准曲线查得相对应的浓度，并按下列公式计算多酚含量。

式中，ω 为多酚含量(mg /g);C 为没食子酸质量浓度(μg/mL);V 为提取液体积(mL);N 为稀释倍数;M 为取样量(g)。

1.2.5 蓝莓中还原糖含量测定

蓝莓中的还原糖含量采用国标法［12］进行测定。吸取5.0 mL 碱性酒石酸铜甲液与5.0 mL 酒石酸铜乙液于150 mL 锥形瓶中，加水10 mL，加入两粒玻璃珠，从滴定管中加比预测体积少1mL 的试样溶液至锥形瓶中，使其在2 min 内加热煮沸，保持沸腾继续以1 滴/2s 的速度滴定，直至蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积，平行测定3 次，得出平均消耗体积。

式中，χ 为试样中还原糖含量(以葡萄糖计)，单位为g/100g;m1为碱性酒石酸铜溶液(甲、乙液各半)相当于某种还原糖的质量，单位为mg;m 为试样质量，单位为g;V 为测定时，平均消耗的试样溶液体积，单位为mL。

1.2.6 酚类物质抑菌活性测定

参照吴启华等［13］方法，对蓝莓提取物进行纯化。各取1 mL 浓度为1 g/mL 的四种蓝莓提取物加入C18反相柱中，以1% HCl 水溶液除去蓝莓中的糖分和有机酸。再用乙酸乙酯对蓝莓中的酚类物质进行洗脱，并收集洗脱液于50 ℃旋转蒸发，除去乙酸乙酯，将浓缩后的酚酸溶于3 mL 无菌水中，置于-20℃保存备用。参照1.2.4 中总酚测定方法，对其中酚类物质的含量进行测定。

将四种蓝莓用无菌TSB 分别配制成2 mL 的浓度为0.2 mg/g 的溶液，用无菌移液器吸取10 μL 5 log CFU/mL 金黄色葡萄球菌菌液，依次接入相应的蓝莓液中，于37 ℃培养24 h，用平板计数法计数。

2 结果与分析

2.1 蓝莓对金黄色葡萄球菌的抑制效果

四种蓝莓提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果见表1。四种蓝莓提取物对金黄色葡萄球菌均有抑制作用。其中，Elliott 和Darrow 对其抑制效果明显强于Bluecrop 和Duke。当蓝莓浓度达到450 mg/mL 时，Elliott 和Darrow 能完全杀死金黄色葡萄球菌。而Duke 和Bluecrop 在450 mg/mL 时，对细菌生长抑制效果不明显。当四种蓝莓浓度达到900 mg/mL 时，均未检测到金黄色葡萄球菌。山梨酸钾溶液在2 mg/mL 时，不能抑制金黄色葡萄球菌的生长。

表1 四种蓝莓对金黄色葡萄球菌的抑菌效果(n=6，±s)Table 1 The antimicrobial effects of four blueberry extracts (n=6，±s)

表1 四种蓝莓对金黄色葡萄球菌的抑菌效果(n=6，±s)Table 1 The antimicrobial effects of four blueberry extracts (n=6，±s)

注:a 表示经24 h 培养后，处理组菌落总数和对照组菌落总数有显著性差异(p ＜0.05)。Note:a Represents a significant (P ＜0.05)difference from control at 24 h(p ＜0.05).

蓝莓品种Blueberries浓度Concentrations(mg/mL)菌落总数Colong-Forming Onits(log CFU/mL)0 h 24 h对照Control 0 5.27 ±0.66 7.79 ±0.38山梨酸钾Potassium sorbate 2 5.27 ±0.66 9.13 ±0.15a杜克Duke 112.5 6.00 ±0.060 8.68 ±0.39 225 5.89 ±0.029 7.31 ±0.30 450 6.05 ±0.12 7.08 ±0.035 900 5.96 ±0.09 6.11 ±0.24a达柔Darrow 112.5 6.06 ±0.60 7.42 ±0.30 225 5.95 ±0.47 7.40 ±0.48 450 6.16 ±0.58 0.00a 900 5.57 ±0.43 0.00a埃利奥特Elliott 112.5 6.00 ±0.44 7.52 ±0.43 225 5.79 ±0.62 6.53 ±0.52a 450 5.41 ±0.33 0.00a 900 5.68 ±0.49 0.00a蓝丰Bluecrop 112.5 5.95 ±0.40 8.38 ±0.37 225 5.98 ±0.46 8.20 ±0.37 450 5.91 ±0.88 7.56 ±0.45 900 5.81 ±0.49 0.00 a

2.2 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)

四种蓝莓提取物和山梨酸钾溶液对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度见表2。

表2 四种蓝莓提取物及山梨酸钾溶液对金黄色葡萄球菌的MIC 及MBC 测定结果Table 2 The MIC and MBC of different blueberry extracts and potassium sorbate

由表可见，四种蓝莓提取物中，Elliott 提取物对金黄色葡萄球菌的抑制效果最强。

2.3 蓝莓中总酚酸和还原糖含量的测定

蓝莓提取物中总酚酸和还原糖含量的含量见表3。其中，Darrow 中总酚酸含量最高，达到1.99 mg/g。Duke 中总酚酸含量最低，仅为1.32 mg/mL。四种蓝莓中，Elliott 中还原糖的含量最低，而Duke 中还原糖含量最高，达191.90 mg/mL。

表3 四种蓝莓中总酚酸与还原糖含量Table 3 The content of total phenolic and reducing sugar of different blueberry extracts

2.4 酚类物质对金黄色葡萄球菌的抑制作用

表4 显示四种蓝莓经分离纯化之后获得的酚类物质中总酚含量。其中，Darrow 中总酚酸含量最高，达到0.46 mg/g，Elliott 中总酚含量次之，Duke中总酚含量最低。图1 显示，蓝莓中酚类物质具有明显的抑菌活性。在0.2 mg/g 的浓度下，酚类物质均能有效杀死金黄色葡萄球菌。

3 讨论

蓝莓味道鲜美、营养丰富，更因其突出的生理活性而备受关注。本研究中四种蓝莓提取物均能显著抑制金黄色葡萄球菌的生长。其中，Elliott(300 mg/mL)和Darrow(350 mg/mL)对金黄色葡萄球菌的抑菌效果尤为显著，均能在低浓度时抑制金黄色葡萄球菌的生长。Bluecrop 和Duke 对金黄色葡萄球菌生长的抑制作用明显弱于Elliott 和Darrow。同时，经纯化所得的蓝莓酚类物质在0.2 mg/mL 时，均对金黄色葡萄球菌显示出显著的抑菌效果。和粗提物的抑菌效果相比较，发现，酚类物质的抑菌活性更强，在0.2 mg/mL 的浓度下就可完全杀灭金黄色葡萄球菌。蓝莓粗提物和酚类物质间抑菌效果的差别可能与其所含成分的复杂程度有关。蓝莓粗提物中所含成分较多，物质间较易发生协同或拮抗作用，从而影响蓝莓的抑菌效果，使其抑菌活力增强或减弱。而蓝莓酚类物质中成分相对简单，物质间的相互作用较少，酚类物质更能显示其抑菌活性。研究结果所示，蓝莓中的酚类物质能为蓝莓的抑菌活性提供了帮助。

表4 四种酚类物质中总酚酸含量Table 4 The content of total phenolic acid of different phenolic compounds

图1 四种酚类物质对金黄色葡萄球菌的抑制活性测定Fig.1 The antimicrobial effect of phenolic compounds against S.aureus

蓝莓是酚类物质的良好来源，具有提高机体免疫力，延缓衰老抗癌等多种生理活性功能［12，13］。本研究不仅研究了蓝莓的抑菌效果，还测定了四种蓝莓中总酚酸和还原糖的含量，发现Darrow 和Elliott粗提物中酚酸的含量明显高于另外两种蓝莓，分别达到1.99 mg/mL(Darrow)和1.75 mg/mL(Elliott)。同时，通过测定纯化后的蓝莓提取物中总酚含量，实验结果显示Darrow 中总酚含量最高，Elliott 中总酚含量次之，而Bluecrop 和Duke 中总酚含量相近。而Darrow 和Elliott 中还原糖含量却明显低于Bluecrop和Duke。研究结果表明，蓝莓中所含的酚酸和还原糖含量因品种不同而具有显著差异，且其抑菌活性和酚酸、还原糖的含量有紧密联系。酚酸是一类苯环上有若干个酚羟基的化合物，其所带有的酚羟基能破坏细菌的细胞膜，使细菌内的蛋白质变性，并可抑制微生物细胞的呼吸酶系与电子传递酶系的活性，从而杀死细菌。故酚酸含量越高，酚羟基的数目也越多，对细菌细胞膜的破坏作用就越强，抑菌效果越明显。

另外，本研究还发现Elliott 的抑菌效果明显强于Darrow 的抑菌效果，但Elliott 中总酚酸的含量却低于Duarrow 中总酚酸的含量。在植物体内酚往往不单是以游离形式存在的，而通过缩醛键与还原糖结合存在，形成糖苷。糖苷在碱性条件下稳定，遇酸易水解。酚酸类物质以糖苷形式存在于蓝莓中，更容易维持其结构的稳定性，从而保护其抑菌活性不受外界环境干扰。在四种蓝莓中，虽然Elliott 中总酚酸的含量低于Darrow 中总酚的含量，但是其所含还原糖含量比Darrow 低，这说明在Elliott 中更多的酚酸类物质能和游离状态的还原糖生成糖苷类，从而有效保证蓝莓的抑菌活性不受外界环境干扰。通过本研究可得出结论，蓝莓抑菌能力和酚含量呈正相关，而与还原糖含量呈负相关。

山梨酸钾抑菌活性实验的测定结果显示，山梨酸钾在低浓度时对金黄色葡萄球菌无抑菌作用，只有在浓度达到100 mg/mL 时方可抑制金黄色葡萄球菌的生长。虽然，山梨酸钾溶液可被人体代谢系统吸收，迅速分解成二氧化碳和水，对人体无毒害，是目前使用最为广泛的抑菌剂，但FDA/WHO 严格规定其在食品中所能使用的最大剂量不能超过2 g/kg。本实验中，山梨酸钾溶液对金黄色葡萄球菌的MIC 已达100 mg/mL，远超过FDA/WHO 所规定山梨酸钾的最大使用剂量。由此可见，山梨酸钾溶液对金黄色葡萄球菌生长的抑制效果不如蓝莓提取物。

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