前胡挥发油胆碱酯酶抑制作用及化学成分研究

刘亚旻，宋 波，李宗阳，姜保平，潘瑞乐

中国医学科学院北京协和医学院药用植研究所 中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室，北京100193

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种以严重的认知和记忆功能减退为临床表现的神经退行性病变［1，2］。其发病机制复杂，尚不完全清楚。目前，被广为接受的病理学说为“胆碱能缺失学说”，其学说认为乙酰胆碱的缺失导致AD 患者认知功能下降，记忆能力丧失［3］。而胆碱酯酶(ChE)是生物神经传导中的一种非常重要的酶，胆碱酯酶会催化乙酰胆碱的裂解反应，导致乙酰胆碱的缺失、神经信号传递失败。胆碱酯酶根据其催化底物的特异性分为乙酰胆碱酯酶(AChE)和丁酰胆碱酯酶(BuChE)。故目前对老年痴呆的药物治疗主要是通过抑制ChE 来提高患者体内的乙酰胆碱水平［4，5］。但是传统的选择性AchE 抑制剂，不但外周副作用较大，且长期用药效果不理想，而选择性BuchE 抑制剂可使细胞外乙酰胆碱浓度增加15 倍，且未发现胆碱样副作用［6-8］。因此，寻找AChE 和BuChE 双重抑制剂为治疗AD 提供了新的思路。本课题组前期运用薄层色谱生物自显影和微孔高通量筛选方法，对40 种抗老年痴呆有潜在作用的中药进行了筛选，结果筛选出11 种具有胆碱酯酶双重抑制作用的中药，其中前胡(Radix Peucedani )是作用较强的中药之一，总ChE 抑制率＞50%。应用水蒸气蒸馏法将前胡分为挥发油和水提物两个部位，对两个部位的胆碱酯酶抑制活性进行筛选，结果表明挥发油具有较好的抑酶作用，而水提物部位作用较弱。本研究对前胡挥发油AChE 和BuChE 的体外抑制作用进行了研究，并运用GC-MS 结合Kovats 指数对挥发油成分进行了结构鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器设备

美国GC (Varian 431-GC Gas Chromatograph，VF-5 布鲁克)/MS(Varian 300-MS TQ Mass Spectrometer)仪;GC-MS Solution 色谱工作站;NIST 05 标准质谱图库;DB-5 毛细管石英柱(0.32 mm ×30 m，0.25 μm，Agilent 公司);挥发油提取器，圆底烧瓶(1000 mL)，冷凝管，烧杯(华西医科大学仪器厂);5 L 恒热电热套(上海中兴仪器有限公司);电子天平(上海天平仪器厂);恒温水浴锅(GB11240-89 型号GSY-II 型 北京医疗);低温高速离心机(Thermo 德国);微孔板扫描酶标仪(BioTek 美国);SSW 型微电脑电热恒水槽(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。

1.1.2 药材与试剂

前胡饮片(购于祥威中药饮片厂，符合《中国药典》及《北京市中药饮片炮制规范》，且由中国医学科学院药用植物研究所张本刚研究员鉴定拉丁学名);正构烷烃参考系C8-C40(美国Chem Service 公司);去离子水;高纯氮;实验小鼠(购自北京军事医学科学院动物中心，均为健康雄性小鼠，体重20～24 g，【SCXK(军)2007-004】);碘化硫代乙酰胆碱(A5751，纯度≥98%)、氯化丁酰胆碱(B2753，纯度≥98%)、5，5’-二硫双硝基苯甲酸(DTNB，D8130，纯度≥98%)、酶终止剂-十二烷基硫酸钠(SDS，纯度＞95%)、他克林(A3773，纯度＞99%)、四异丙基甲基焦磷酰胺(ISO-OMPA，T1505，纯度＞99%)，均购自SIGMA 公司;PBS 磷酸缓冲盐溶液(索莱宝生物科技公司);96 孔板(Costar 3599 美国);二甲基亚砜(DMSO)、乙醇、环己烷等化学试剂为分析纯(北京化工厂)。

1.2 方法与结果

1.2.1 试液的制备

1.2.1.1 供试液的制备

取上述前胡中药饮片粉碎，过40 目筛，称取200 g，加10 倍量水浸泡过夜后，用挥发油提取器按《中国药典》附录之挥发油测定法甲法项下测定，蒸馏至挥发油量不再增加，放置1h 后读取挥发油量为2.1 mL，并计算提取率，经无水硫酸钠干燥即得。前胡挥发油为橙黄色油状物，具有特殊香味。取前胡挥发油0.1 mL，以环己烷稀释100 倍作供试品备用，即浓度为1 μL/mL。

前胡挥发油的提取率(%)=前胡中挥发油含量/前胡重量×100% =1.05%

1.2.1.2 底物的配制

分别取7.2 mg 碘化硫代乙酰胆碱和氯化丁酰胆碱，分别用PBS 溶液定容于2 个5 mL 的棕色容量瓶中，低温保存，使用时每毫升用PBS 溶液稀释40 倍。

1.2.1.3 显色剂的配制

取25 mgDTNB 用PBS 溶液定容于25 mL 棕色容量瓶中，用时现配，避光保存。

1.2.1.4 酶终止剂的配制

取酶终止剂-十二烷基硫酸钠3 g 溶解于100 mL PBS 溶液。

1.2.2 酶液的制备与活力的测定［9，10］

酶液源于小鼠(C57 品系正常小鼠，购自北京军事医学科学院动物中心，【SCXK(军)2007-004】)的肝脏。将小鼠断颈猝死，取其肝脏1 g 于玻璃匀浆器中，按1∶9(W/V)加入冰冷的PBS 磷酸盐缓冲液(PH=7.4)，研成匀浆状，移入离心管中4 ℃离心30 min(3000 转/min)，吸取上清液贮于-20 ℃冰箱中备用。使用前加入冰冷的PBS 磷酸盐缓冲液(PH=7.4)稀释至约10 mL.酶活力的测定见参考文献［10］。

1.2.3 前胡挥发油的胆碱酯酶抑制作用

1.2.3.1 乙酰胆碱酯酶抑制活性

采用改良的Ellman［11］方法:实验设空白组，溶剂对照组，样品组及阳性对照组，反应体系中各加入32 μL 酶液、160 μL(浓度为1 μL /mL)样品抑制剂(溶剂对照组抑制剂为1‰DMSO，阳性对照组抑制剂为浓度1 mg/mL 阳性药他克林)和400 μL 显色剂DTNB(空白组在加完DTNB 后加入400 μL SDS终止反应)，补水至1.2 mL，37 ℃孵育5 min，加入底物400 μL 碘化硫代乙酰胆碱37 ℃孵育15 min，再加入400 μL SDS 终止反应，用酶标仪在波长为412 nm 处测定吸光度值，计算乙酰胆碱酯酶抑制率，乙酰胆碱酯酶抑制率(%)={1-(A 样本-A 空白)/(A 对照-A 空白)}×100%。实验重复三次，结果见表1。

1.2.3.2 丁酰胆碱酯酶抑制活性

采用改良的Ellman［11］方法，具体操作方法与乙酰胆碱酯酶抑制活性测定相同，将其底物碘化硫代乙酰胆碱换成氯化丁酰胆碱即可，其中阳性对照组抑制剂为浓度1 mg/mL 阳性药四异丙基甲基焦磷酰胺，结果见表1。

表1 前胡挥发油的乙酰胆碱酯酶及丁酰胆碱酯酶抑制率Table 1 The inhibition ratio of acetyl cholinesterase and butyryl cholinesterase in the volatile oil of Radix Peucedani

1.2.3.3 前胡AChE-IC50和BuChE-IC50

吸取前胡挥发油3 μL，定容于3 mL 的DMSO中，浓度为1 μL/mL. 倍比稀释为以下8 个浓度0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125 μL/mL。采用改良的Ellman 方法［11］:实验设空白组，溶剂对照组，样品组及阳性对照组，反应体系中各加入32 μL 酶液、160 μL 不同浓度的供试品溶液挥发油抑制剂(溶剂对照组抑制剂为1‰DMSO，阳性对照组抑制剂分别为浓度1 mg/mL 阳性药他克林和四异丙基甲基焦磷酰胺)和400 μL 显色剂DTNB(空白组在加完DTNB 后加入400 μL SDS 终止反应)，补水至1.2 mL，37 ℃孵育5 min，加入底物400 μL ATCH(碘化硫代乙酰胆碱)37 ℃孵育15 min，再加入400 μLSDS 终止反应，用酶标仪在波长为412 nm 处测定吸光度值，分别计算乙酰胆碱酯酶抑制率，乙酰胆碱酯酶抑制率(%)={1-(A 样本-A 空白)/(A 对照-A 空白)}×100%。实验重复三次，结果见表3。根据改良寇式法计算出其IC50:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm。其中lg 为 最大剂量，I 为l g(最大剂量/ 相临剂量)，P 为阳性反应率之和，Pm为最大阳性反应率，Pn 为最小阳性反应率，实验结果见表2。

表2 前胡挥发油的AChE-IC50和BuChE-IC50值Table 2 the value of AChE-IC50 andBuChE-IC50in the volatile oil of Radix Peucedani

1.2.4 GC-MS 对前胡挥发油化学成分的结构确定

1.2.4.1 色谱条件

色谱柱DB-5 毛细管石英柱(0.32 mm ×30 m，0.25 μm，Agilent 公司)

检测器温度:300 ℃，气化室温度:300 ℃，柱前压:137.2 kpa，载气:He，载气流速:1.0 mL/min，尾气流速:50 mL/min，进样方式:分流进样，分流比:1:50，进样量1 μL。

程序升温:40 ℃保持10 min，以1 ℃/min 至45℃，保持1min;以12 ℃/min 至220 ℃，保持2 min;以3 ℃/min 至290 ℃，保持1 min。进样口温度:300 ℃。质谱条件:EI 源，电离能量:70 eV，离子源温度:230 ℃。扫描范围:m/z 35～450。

1.2.4.2 样品的测定

取前胡挥发油供试品1 μL，按上述优化后的GC-MS 条件进样测定。总离子流图见图1。

图1 前胡挥发油总离子流图Fig.1 Total Ion Chromatogram of the volatile oil in Radix Peucedani

1.2.4.3 挥发油化学成分结构确定

通过GC-MS 质谱库与保留指数联合定性从前胡挥发油中鉴定出32 种主要化学成分，以面积归一法计算，占总峰面积的88.34%，主要成分有α-蒎烯，左旋-β-蒎烯，月桂烯，1-甲基-3-(1-甲基乙基)苯，(R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己烯，2-癸酮，萜品醇，2-羟基-5-甲基苯乙酮，柏木脑等，详见表3。

表3 前胡挥发油主要化学成分Table 3 The main chemical constituents in volatile oil of Radix Peucedani

2 结论与讨论

2.1 GC-MS 质谱库结合Kovats 指数鉴定挥发油结构更准确

2.2 前胡有可能成为抗老年痴呆的候选药物

前胡为伞形科植物白花前胡Peucedanum praeruptorum Dumn 的干燥根，具有散风清热，降气化痰的功效，用于治疗风热咳嗽痰多，痰热喘满，咯痰黄稠［22］。现代药理研究表明前胡还具有抗心脏缺血、保护心肌、改善心脏功能、扩张血管、降低血压、抗氧化等多种活性［23］。本文以薄层色谱(TLC)-生物自显影技术及微孔高通量筛选方法研究前胡胆碱酯酶抑制活性，结果表明前胡挥发油对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶均具有抑制作用。本文研究结果提示前胡有可能对老年痴呆等神经退行性疾病有一定的治疗作用。

1 Guo JJ(郭静静)，Liao H(廖红)，et al.Advance of drugs for treatment of alzheimer's disease. J China Pharm Univ 中国药科大学学报)，2010 :395-400.

2 Yin SW(殷帅文)，Huang FC(黄风春)，Zhang YY(高圆圆)，et al.Evaluation of acetylcholinesterase inhibitory activity of different plant belonging to pteridophyta extracts. Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2009:854-857.

3 Fang L(方立)，Chen Y (陈瑶)，Zhang YH(张奕华).Advances in the researches on cholinesterase inhibitors for the treatment of alzheimer's disease. Prog Pharm Sci(药 学进展)，2009:289-296.

4 Liu YL(刘艳玲)，Li NY(李奴英). Research progress on the treatment of alzheimer's disease by cholinesterase inhibitors.Shanxi Med J(山西医药杂志)，2008(1):64-66.

5 Xing HY(邢宏义)，Sun SG(孙圣刚).Research progress on Acetylcholine system in alzheimer's disease.Foreign Medical Sciences Section on Neurology ＆Neurosurgery(国外医学. 神经病学神经外科学分册)，2000:262-264.

6 Zhang JT(张均田). The pathogenesis and treatment strategies of alzheimer's disease. Acta Pharm Sin(药学学报)，2000:635-640.

7 Gao M (高梅)，Liu AL (刘艾林)，Du GH (杜冠华)，et al.High-throughput screening for butyrylcholinesterase inhibitors.Chin New Drugs J(中国新药杂志)，2009:1145-1148.

8 Bartorelli LG，Iraldi C，Saccardo M，et al.Effects of switching from an AChE inhibitor to a dual AChE-BuChE inhibitor in patients with Alzheimer’s disease.Curr Med ResOpin，2005，21:1809-1818.

9 Xu W(徐婉)，Chen YS(陈源世)，Liu Y(刘跃)，et al.Common trace analysis of poison(常见毒物的微量分析)，1st Ed.Beijing:People Press，1982.300.

10 Song B(宋波)，Li ZY(李宗阳)，Liu YM(刘亚旻)，et al.Inhibitory effect of radix Angelicae Pubescentis on activities of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase. Cent South Pharm(中南药学)，2011:721-724.

11 Perry NS，Houghton PJ，Theolad A，et al.In-vitro inhibition of human erythrocyte acetylcholinesterase by Salvia lavandulaefolia essential oil and constituent terpenes.J Pharm Pharmacol(药学与药理学杂志)，2000，52:895-902.

12 Vanden DH，Kratz PD.A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas—liquid partition chromatography.J Chromatogr，1963，11:463-471.

13 Zhao CX(赵晨曦). Research progress on the qualitative method of gas chromatographic retention indices. Anal Chem(分析化学)，2005:715-721.

14 Zhang F(张斐)，Chen B(陈波)，Yao SZ(姚守拙). Research on chemical compositions in the volatile oil of Peucedanum decursivum Maxim. by GC-MS. China Tradit Herb Drug(中草药)，2003(10):22-23.

15 Yan JC(闫吉昌)，Composition analysis in the volatile oil of Radix Peucedani.RenShengYanJiu(人参研究)，1995(3):34-35.

16 Wei R(魏冉)，Kong LY(孔令义)，Hou BL(侯柏玲)，et al.Research on chemical compositions in the volatile oil of Peucedanum praeruptorum Dunn. J Shenyang Pharm Univ(沈阳药学院学报)，1994:201-203.

17 Long GQ(龙刚强)，Liu BM(刘布鸣)，Zhang HL(张慧玲)，et al.Research on chemical compositions in the volatile oil of Radix Peucedani by GC/FTIR. Guangxi Chemical Industry (广西化工)，1995(1):32-34.

18 Liu BM(刘布鸣)，Lai MX(赖茂祥)，Peng W(彭维)，et al.Research on chemical compositions in the volatile oil of Guangxi Radix Peucedani. China Tradit Herb Drug(中 草药)，1996:588-589.

19 Ji L(吉力)，Xu ZL(徐植灵)，Pan JG(潘炯光)，Research on chemical compositions in the volatile oil of Peucedanum pubescens by GC-MS.China J Chin Mater Med(中国中药杂志)，1993:294-295.

20 Kong LY(孔令义). Research on chemical compositions in the volatile oil of Peucedanum praeruptorum Dunn. J Shenyang Pharm Univ(沈阳药学院学报)，1994:201-203.

21 Zhou GL(周国莉). Analysis of volatile oil components of Peucedanum praeruptorum and Peucedanum decursivum. J Trad Chin Med Univ of Hunan (湖南中医药大学学报)，2010(5):26-28.

22 Chinese Pharmacopoeia Commission(国家药典委员会).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中华人民共和国药典). Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol Ⅰ，11.

23 Wu X(吴霞)，Bi Y(毕赢)，Wang YT(王一涛)，et al.Progress on chemical compositions and pharmacological action of Peucedanum praeruptorum Dunn.Food and Drug(食品与药品)，2010:442-445.