黄连-黄芩药对化学成分的UPLC-PDA-MS 分析

张晓雷，周明眉 ，赵爱华，苟小军，吴建兵，恽祥惠，邢丽娜

1上海中医药大学;2 海绿谷制药有限公司，上海201203;3 上海交通大学药学院，上海200240

黄连、黄芩配伍使用出自《伤寒论》，《医宗金鉴》名曰二黄汤。在中药复方中出现频率较高，如泻心汤、黄连解毒汤、葛根芩连汤、普济消毒饮等;2010版药典中，黄芩黄连在20 多个复方中配伍使用。

中药的配伍不等于简单的药物加和，不同的中药配伍具有不同的药效，其药效物质基础也会有所不同。有关黄连黄芩药对配伍的物质基础研究较少，其中李伟等［1］用毛细管电泳及液相色谱法研究黄连黄芩配伍过程化学成分的变化，发现黄连黄芩共煎产生沉淀，使有效成分的含量降低;齐粱［2］等应用聚酰胺柱层析、薄层层析和飞行时间质谱对黄连黄芩药对煎煮液的沉淀物进行了分析，沉淀物主要成分为药材中的有效成分黄连碱、小檗碱、表小檗碱、巴马亭、药根碱及黄芩甙、汉黄芩甙等。尽管如此，但其研究内容和方法有所不同。UPLC 是近年来新兴的一种色谱技术，它采用小颗粒填料色谱柱(粒径小于2 μm)和超高压系统(压力大于105kPa)的新型液相色谱技术，能显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度，同时大大缩短分析周期［3］，因此特别适用于微量复杂混合物的分离和高通量研究。本文利用UPLC-PDA-MS 技术对黄连、黄芩、黄连黄芩药对，以及含黄连黄芩的中成药中的化学成分进行系统研究，建立全面反映黄连-黄芩药对化学成分的分析方法，并进行定性及定量分析，最大限度的获取相应的化学信息，从而为阐明黄连黄芩的配伍机制奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 实验药品及药材

盐酸药根碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、黄芩苷、汉芩黄苷、黄芩素、汉黄芩素及千层纸素A 购自上海融禾生物有限公司(纯度＞99%);黄连饮片(批号080201)产地四川，购于上海同济堂;黄芩饮片(批号080123)产地河北，购自上海康桥中药饮片有限公司。中成药［三黄片(SHT)、一清颗粒(YQG)、牛黄上清丸(NHSQP)、蛤蚧定喘胶囊(GJDCC)及葛根芩连片(GGQLT)］购自上海养生堂。

1.2 实验仪器

Waters 超高效液相色谱-串联质谱仪(ACQUITY/ZQ2000，美国WATERS 公司)，配有Quity 二极管阵列检测器(PDA)、电喷雾离子化源(ESI)、Masslynx 4. 1 工作站等;BP211D 型1/10 万电子天平(Satorius Co.，Ltd，德国)等。

1.3 实验试剂

甲醇(Fisher，美国)、甲酸(Tedia Company，美国)均为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

2.1.1 色谱条件

色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm ×2.1 mm，1.7 μm);流动相:0.05%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)，梯度洗脱(0～2 min，88%→75% A;2～4 min，75%→69% A;4～6 min，69%→68% A;6～10 min，68%→35% A;10～11 min，35%→35%A;11～12 min，35%→88% A;12～14 min，88%→88% A);流速:0.35 mL/min;柱温:30 ℃;进样体积:3 μL;紫外检测波长:280 nm。

2.1.2 质谱条件

离子源:电喷雾离子源(ESI 源);检测方式:正离子模式(［M +H］+);扫描方式:一级全扫描;喷雾电压:3.0 KV;锥孔电压:50 V;雾化气流量:500 L/h;脱溶剂温度:350 ℃;离子源温度:120 ℃。

2.2 对照品溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的配制

分别精密称取对照品盐酸药根碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素及千层纸素A 各约1000 μg，于10 mL 容量瓶中，加适量甲醇超声溶解并稀释至刻度线，得各对照品储备液。取各对照品储备液适量，分别稀释，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得各对照品溶液。

2.2.2 混合对照品溶液的配制

分别精密称取盐酸药根碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、黄芩苷、汉芩黄苷、黄芩素、汉黄芩素及千层纸素A 各约1000 μg 于同一10 mL 的容量瓶中，加适量甲醇超声溶解并稀释至刻度线，得混合对照品储备液(各成分浓度分别为136、99、93、92、117、110、106、115 μg/mL)。取混合对照品储备液适量，稀释，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得混合对照品溶液。

2.3 供试溶液的制备

2.3.1 提取物的制备

黄连、黄芩药材分别粉碎至过20 目筛，干燥后分别称取黄连50 g、黄芩50 g、黄连-黄芩药对(1∶1)100 g，按1∶10(g∶mL)加水，浸泡30 min 后煎煮60 min，趁热滤过，药渣加8 倍量水再提取60 min，合并两次提取液，静置至室温，3000 rpm 离心10 min，收集各上清液及黄连黄芩药对(1∶1)沉淀，上清液70℃减压浓缩，浓缩至稠膏;各稠膏及沉淀80 ℃真空干燥至恒重，称重(平行三份，黄连平均提取率22.60%，黄芩平均提取率51.83%，黄连黄芩药对平均提取率13. 38%，黄连黄芩药对平均沉淀率27.52%)，备用。

2.3.2 供试溶液的制备

2.3.2.1 药材供试溶液的制备

分别称取干燥药材粉末:黄连50 mg、黄芩50 mg、黄连-黄芩药对(1∶1)50 mg，于10 mL 带塞玻璃离心管中，加65% 甲醇8 mL 称重;室温超声60 min，称重并用65%甲醇补足减失重量，3000 rpm 离心10 min，精密吸取上清液，适当稀释后0.22 μm微孔滤膜过滤，即得各供试样品溶液。

2.3.2.2 提取物供试溶液的制备

分别称取干燥提取物粉末:黄连25 mg、黄芩25 mg、黄连-黄芩药对(1∶1)25 mg 及药对沉淀10 mg于10 mL 带塞玻璃离心管中，其余操作步骤同上2.3.2.1。

2.3.2.3 含黄连黄芩药对的中成药供试溶液的制备

分别称取干燥中成药粉末:SHT 50 mg、YQG 50 mg、NHSQP 50 mg、GJDCC 50 mg 及GGQLT 50 mg 于10 mL 带塞玻璃离心管中，其余操作步骤同上2.3.2.1。

2.4 方法专属性考察及色谱峰的定性分析

2.4.1 色谱峰来源归属及专属性考察

分别取上述配制的各对照品溶液、混合对照品溶液及供试样品溶液，UPLC 自动进样3 μL，使用优化的梯度洗脱条件洗脱，确定各对照品、混合对照品及供试样品中各成分的保留时间。色谱图见图1(I～X)，由图1 可知，黄连黄芩药对提取液中共检测到十二个主要的色谱峰。其中第1、2、3、4 和5 号峰均来自黄连，第6、7、8、9、10、11 和12 号峰均来自黄芩。这12 个主要的色谱峰保留时间各不相同，其他各峰互不干扰，证明该方法可行，专属性较高，选择性好。

图1 超高效液相色谱图Fig.1 Typical UPLC chromatograms of the mixed

2.4.2 色谱峰的定性分析

通过比较供试样品和对照品的色谱峰保留时间(tR)，PDA 采集的色谱峰光谱和正离子方式检测所得质谱信息，确定峰3、4、5、6、9、10、11 和12 分别为药根碱、小檗碱、巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素A。峰2 的紫外光谱与峰4(小檗碱)相似(见图2-II)，质谱图显示也极其相似(见图2-I)，且分子离子均为m/z 336，根据有关文献［1，4］，推断为表小檗碱。峰1 的质谱显示分子离子为m/z 320(见图2-I)，并根据有关文献［1，4］，推断为黄连碱。色谱峰1、2、3、4 及5 的质谱信息，与文献［4］报道相符。

图2 部分黄连成分(1、2、3)的质谱图(I);部分黄连成分(2、3)的紫外吸收图(II)(3 小檗碱)Fig.2 Typical MS spectra of components 1，2，3 in Coptis (I);Representative UV spectra of components 2，3 in Coptis (II)(3.berberine)

2.5 线性关系的考察

精密量取上述配制的混合对照品储备液适量，分别稀释为10、30、100、300、1000、2000 倍等不同浓度的混合对照品系列溶液，过滤进样，PDA 检测，以8 种对照品的质量浓度(x，μg/mL)为横坐标，相应的峰面积为纵坐标(y)，得回归方程，见表1。

表1 各成分的线性回归方程及LOD 测定结果Table 1 Linear regression equation and LOD data of the 8 identified compounds

2.6 精密度试验

取“2.5”项下所配制的稀释100 倍的混合对照品溶液，重复进样6 次，PDA 检测，计算各峰峰面积的RSD 值，结果分别为:盐酸药根碱0.10%、盐酸小檗碱2.02%、盐酸巴马汀2.12%、黄芩苷0.45%、汉黄芩苷0.15%、黄芩素2.35%、汉黄芩素1.15%和千层纸素A 0.52%。说明精密度良好。

2.7 稳定性试验

取上述所配制的药对提取物供试样品溶液，分别在制备后的第0、3、6、12、16、24 小时进样，PDA 检测，计算各成分峰面积的RSD 值，结果分别为:药根碱3.26%、小檗碱4.32%、巴马汀4.63%、黄芩苷3.80%、汉黄芩苷4.92%、黄芩素4.61%、汉黄芩素4.47%和千层纸素A 3.78%。结果表明，8 个成分至少在24 h 内稳定。

2.8 重复性试验

平行制备6 份药对提取物供试样品溶液，进样，PDA 检测，计算各成分峰面积的RSD 值，按所研究各成分的峰面积来考察重复性;结果RSD 值分别为:药根碱3.59%、小檗碱2.01%、巴马汀4.9%、黄芩苷1.13%、汉黄芩苷4.88%、黄芩素3.89%、汉黄芩素2.95%及千层纸素A 4.62%。结果表明:该方法重复性良好。

2.9 回收率试验

精密称取9 份黄连-黄芩药对(1∶1)干燥药材粉末，分别于10 mL 带塞玻璃离心管中;每份10 mg，每3 份为1 组，各组分别加入混合对照品储备液(各成分浓度分别为136、99、93、92、117、110、106、115 μg/mL)1、0.5、0.1 mL 做为高、中、低加样组，然后再分别加65%甲醇至8 mL，称重后按供试样品溶液制备及测定方法进行操作，根据实际测得含量和已知含量的差值计算回收率。结果各成分高、中、低加样回收率的平均值分别为:药根碱101. 52%、101.88%、103. 33%;小檗碱99. 29%、103. 91%、100.97%;巴马汀103. 76%、105. 47%、106. 77%;黄芩 苷102. 33%、94. 29%、99. 96%;汉 黄 芩 苷101.32%、99. 69%、96. 27%;黄 芩 素103. 75%、104.19%、105.27%;汉黄芩素104.53%、97.90%、99. 75%;千 层 纸 素 A 104. 18%、109. 09%、109.17%。各成分高、中、低加样回收率的RSD 均小于5.0%。结果表明:该方法准确、可行。

2.10 样品测定

取上述所配制的各供试样品溶液，进样，PDA检测，根据标准曲线计算各成分含量。按药根碱、小檗碱、巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素及千层纸素A 的含量来研究药对黄连、黄芩配伍的相互作用;此外，利用所建立的方法成功地对含该药对的部分中成药进行了质量考察，其结果见表2。实验发现，黄连配伍黄芩后，产生大量黄色絮状沉淀，使黄连黄芩提取物重量降低26%;对药对提取物及沉淀进行分析与测定，发现提取物中含药根碱0. 75%、小檗碱0. 45%、巴马汀2. 03%、黄芩苷8.56%、汉黄芩苷3.89%、黄芩素0.51%，而沉淀中含药根碱1.08%、小檗碱17.45%、巴马汀1.12%、黄芩苷37.31%、汉黄芩苷4.04%、黄芩素0.81%，均高于提取物，其中小檗碱、黄芩苷最多。

表2 样品测定结果(平均结果，mg/g，n = 3)Table 2 Quantification results of samples (All data expressed as mean，mg/g，n = 3)

3 小结与讨论

本实验在同一条件下，对黄连、黄芩及黄连黄芩药中的化学成分进行系统研究，建立全面反映黄连、黄芩及黄连黄芩药对所含化学成分的分析方法，效果较好，方法简单、方便、可行，并与有关文献［1，5］相比，也大大的缩短了分析时间;应用该方法对黄连、黄芩及黄连黄芩药对进行定性及定量分析，最大限度的获取相应的化学信息，从而为阐明黄连黄芩的配伍机制奠定基础;并且还成功地对部分含该药对的中成药进行了含量测定。本实验可以定性并能定量的成分较多，虽然只测定其中8 种成分，但可为中药及中药制剂的质量标准制定提供了一个较为合理的思路;目前，中药及中药制剂的质量标准制定，往往以其中的一种或两种成分为指标进行质量控制，但中药的疗效往往是多种中药或多种成分的协同作用，所以以其中的一两种成分作为质量控制指标缺乏科学性，若尽可能多的检测相关成分，则可显著提高中药或中药制剂的质量标准，为其安全有效可控提供可靠保障。

实验中发现药对混煎时，提取物重量降低近30%，同时也发现沉淀中主要含有与煎液成分相同的化学成分，即药根碱、小檗碱、巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、及汉黄芩素等，与有关文献［1，2］一致。沉淀中小檗碱、黄芩苷分别多达17. 45%、37.31%，远远高于提取物中的相应含量0. 45%、8.56%。此外大量研究证实，产生沉淀的原因是由于黄连中的原小檗碱型生物碱为碱性化合物，与黄芩中的多酚类化合物黄芩苷等酸性化合物相互结合，生成分子量较大的水不溶物而产生沉淀，同时药理实验也证明沉淀物具有药效作用［2］。根据中医理论，黄连黄芩药对属清热燥湿配伍的经典药对，二者皆属苦寒之品，均能清热燥湿、泻火解毒，常相须合用起协同作用，以发挥最佳疗效;由于中药方剂传统入药方式为汤剂，其配伍共煎后产生的沉淀大部分以混浊液的形式一起服用，而沉淀一般是两类成分形成的复合物，进入人体内，受环境影响不断解离，起到缓释的作用，对临床疗效的影响不大，而对于相关的成药或有关研究，由于制备工艺中的过滤步骤除去了大部分沉淀，势必对其疗效造成较大影响;在中医处方中常见对特殊药味的“先煎”、“后下”、“另炖”等医嘱，其实都是前人通过实践摸索出各药味的性质后，为避免其有效成分的损失或增加煎出量而采取的相应措施。因此，在明确了含酸碱成分对药的方剂煎煮会导致酸、碱性有效成分煎出量减少这样的事实，就应该采用分煎方式，尽量避免有效成分的损失，以保证有效成分最大限度的保留;传统的汤剂人药也可以考虑“另煎”(即分煎)的方式，以提高疗效，降低费用。

本实验采用药材和水1∶10 的提取溶剂比例，目的考察其习惯提取方法的提取效率及药对配伍在提取过程中的相互影响，此外根据黄连、黄芩有效成分的溶解性(黄芩苷溶解度甲醇1569 μg/mL、乙醇1458 μg/mL、水60 μg/mL［6］)及有关文献［7］，分别进行溶媒甲醇及65%甲醇水提取预试验，结果发现采用65%甲醇提取各有效成分效果较好，故采用65%甲醇提取并进行相应的定性定量分析，结果取得满意效果。

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3 Waters Corporation.UPLC TM:Separation Science Redefined.2006，720000880.

4 Deng YT(邓雅婷)，Liao QF(廖琼峰)，Bi KS(毕开顺)，et al.Analysis of the main components of Coptis-Evodia herb couple by HPLC-DAD-MS. Acta Pharm Sin(药学学报)，2008，43:299-302.

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