即刻种植即刻负重中PRF 对硬组织修复的促进作用*

徐 普 朱亚丽 刘德裕 李晓敏 毛小泉 吴 卉 程亚楠

人体自身血液制品在促进愈合方面的研究很多，在口腔种植临床的应用也越来越受到大家的关注[1-4]。富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)为第二代的血小板凝集物，是具有粘性的富含高浓度纤维蛋白原及多种生长因子的血小板凝胶。有研究认为，以纤维蛋白为基础的白细胞与血小板凝集物能促进头面部的成骨细胞生长，从而促进硬组织的愈合[5]。

有研究显示，PRF在口腔种植手术后能加快硬组织的改建速度[6-7]，但PRF单独应用于动物的种植实验研究，尤其是即刻种植即刻负重中使用PRF的研究，国内至今未见报道。本研究将PRF引入口腔即刻种植即刻负重中，通过动物实验的方法描述其修复硬组织的情况，以指导进一步的动物实验研究和临床应用。

1.材料与方法

1.1主要仪器与材料 种植机(Nobel，奥地利)；便携式X射线机(ADX 4000，韩国)；台式低速离心机(TD4Z-WS，长沙)；柱形螺纹纯钛种植体(Osstem，韩国4×10mm，共10支)。

1.2实验对象 健康纯种雄性beagle犬(沈阳康平实验动物研究所提供)5只，体重约13-16kg，年龄为24个月。要求牙体、牙列完整，无牙体牙周疾病，咬合关系正常。所有实验动物适应性饲养一个月后进行实验。

1.3 PRF制备方法 术前用头皮针从实验动物下肢小隐静脉抽取10m l血液放入10m l离心管中，并立即置于低速离心机中以3000rpm/m in，经10m in离心后备用。

1.4实验方法

1.4.1动物模型制备 在30g/L戊巴比妥钠溶液静脉麻醉下，拔除5只beagle犬双侧下颌第四前磨牙(PM 4)，立即常规植入种植体。使种植体颈部与牙槽窝边缘骨嵴平齐，并旋入牙龈成形器以形成即刻负重，必要时对牙龈成形器进行调磨消除咬合高点。

1.4.2缺损制备标准 采用自身对照方式，每只犬采用随机法区分对照侧与实验侧，用骨凿在种植体颊侧制备约4mm×5mm缺损，暴露种植体上部(图1)；制备实验侧牙槽间隔约3mm×3mm缺损，对照侧牙槽间隔处不制备缺损。实验组采用PRF填塞种植体颊侧缺损，远中间隔缺损和拔牙窝；对照组种植体颊侧缺损仅以出血形成的血凝块充填，间隔不制备缺损，拔牙窝用明胶海绵填塞，可吸收缝线关闭创口。

1.4.3取材及HE切片制作 3个月后手术切开观察骨缺损位置新骨形成情况，并测量记录，同时在双侧种植体颊侧缺损修复区、间隔和拔牙窝骨质处取材，常规制作骨组织HE切片并在光镜下观察，并对骨组织中成骨细胞多少和骨基质的矿化程度做出基本判断。

1.5统计方法 本实验使用SPSS17.0软件包对数据进行统计学处理，结果以均数±标准差(M±SD)表示，各组间比较采用两独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1缺损处骨量的变化 实验组远中拔牙窝及牙槽间隔骨已与周围骨面平齐，种植体颊侧已由原来的矩形缺损变为倒三角形缺损，骨的生成量不等(图1，图2)。对照组远中拔牙窝骨组织与周围骨面平齐，种植体颊侧矩形骨缺损也有部分骨组织生成。以种植体颈缘近、远中骨嵴最高处连线(种植体颈缘)为标记线，记录PRF置入当时及三个月后颊侧骨缺损最低点至标记线的垂直距离，以确定颊侧骨缺损的高度的变化，计算出骨增加的高度和余留骨缺损的面积(图3)。

图1 2号犬实验颊侧即刻种植后(箭头示骨缺损区)

图2 2号犬实验颊侧即刻种植后3个月(牙龈成形器已取下，箭头示骨缺损已基本恢复)

图3 颊侧骨缺损最低点至标记线(a)的垂直距离(b)

表1显示3个月后种植体颊侧缺损处新生骨质的高度和面积。因为第二只动物实验组种植体脱落，所以统计时没有第二只动物实验组的数据。本研究为小样本资料，实验组颊侧新生骨高度平均为2.60mm，对照组为1.60mm，P<0.05(表1)；实验组颊侧余留骨缺损面积平均为1.45mm2，对照组3.00mm2，P<0.05(表2)。两组数据差异都有统计学意义。可以认为，实验组骨组织增加的高度多于对照组，余留缺损面积小于对照组，即PRF有利于骨组织的生成。

表1 3个月后种植体颊侧缺损骨增加高度(mm)

表2 3个月后骨缺损区的面积比较(mm2)

2.2骨组织切片观察结果

2.2.1颊侧新生骨组织 种植体植入3个月后种植体颊侧骨组织切片观察，实验组(图4)可见大量血管、成骨细胞和矿化程度不等的骨组织生成，骨小梁致密；对照组(图5)也可见血管，成骨细胞和矿化程度不等的骨组织生成，但是成骨细胞的数量比实验组略少。

图4 3号犬实验组种植体颊侧骨(HE染色×100)

图5 3号犬对照组种植体颊侧骨(HE染色×100)

2.2.2远中拔牙窝新生骨组织 观察种植体植入3个月后种植体远中拔牙窝骨组织切片，实验组可见大量血管、成骨细胞和矿化程度不等的骨组织生成，骨小梁致密(图6)；对照组血管明显比实验组少，也有成骨细胞和矿化程度不等的骨组织，但成骨细胞的数量比实验组略少(图7)。

图6 5号犬实验组原远中拔牙窝骨(HE染色×100)

图7 5号犬对照组原远中拔牙窝骨(HE染色×100)

2.2.3牙槽间隔新生骨组织 观察种植体植入3个月后种植体远中牙槽间隔骨组织切片，实验组(图8)可见大量血管、成骨细胞和矿化程度不等的骨组织生成，骨小梁致密粗大，与对照组正常骨组织(图9)无明显差别。

图8 2号犬实验组新生牙槽间隔骨(HE染色×100)

图9 2号犬对照组正常牙槽间隔骨(HE染色×100)

3.讨论

富血小板纤维蛋白(PRF)为第二代的血小板凝集物，是具有粘性的富含高浓度纤维蛋白原及各种生长因子的血小板胶，与第一代血小板凝集物富血小板血浆(PRP)最大的不同是PRF制备简单快捷，不需要添加任何人工的生物化学试剂[7]。本研究制备的PRF凝胶在盐水纱布上，可挤压成有一定形状的弹性薄膜，根据需要修剪成小块；而PRP只能形成凝胶而不能压缩成膜，这就是PRP不能单独作为骨的修复材料使用，而PRF可以单独作为骨修复材料的原因[8]。

在骨组织的愈合中，血凝块要为各种成骨相关的细胞提供增殖分化的场所，所以其形成至关重要。PRF中的纤维蛋白网架结构与血凝块内的纤维蛋白的结构极其相似，有序、致密，数量丰富，并含大量的白细胞和多种生长因子，因此，PRF中的纤维蛋白网不但为骨缺损区提供了类似凝血块的网格支架功能，其中的大量白细胞增强PRF抗炎能力，同时其多种生长因子还可促进骨缺损区的生长与愈合[9,10]。大体观察发现，种植3个月后实验组新生骨的生成能力、改建和重塑能力强于对照组(图1，图2；表1，表2)；而组织学观察发现，种植体颊侧和远中拔牙窝实验组比对照组成骨细胞要多，但骨组织的成熟度相差不大(图3-图6)，和正常骨组织也没有明显区别(图7，图8)，即PRF的作用主要体现在量的优势。

PRF的作用时间为7-11天，长于第一代血小板凝集物富血小板血浆(PRP)的3-5天，且作用稳定。PRF主要是早期促进成骨作用，即在成骨的早期，持续释放大量细胞因子，如转化生长因子(TGF-β1)、血小板源性生长因子(PDGFs)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)等[11,12]，增加了实验组成纤维细胞和成骨细胞的数量和活性，促进血管的生成等。

在这些因子中TGF-β 作为趋化因子可以在种植床周围吸附大量骨母细胞，刺激成骨细胞的增殖，增加骨细胞的数量，抑制破骨细胞的形成；促进成骨细胞基质的沉积和成纤维细胞基质的形成。PDGF不仅可刺激骨髓基质细胞的有丝分裂以增加骨细胞的数量，还可刺激内皮细胞的有丝分裂，促进种植区毛细血管的生长，使成骨细胞趋化增殖并增加胶原蛋白合成的能力。IGF不仅刺激成骨细胞和前成骨细胞，促进软骨和骨基质形成，还可通过介导作用调节成骨细胞和破骨细胞的分化形成及功能活性，在骨改建耦联中发挥重要作用。而后期的愈合则有赖于成骨细胞的自分泌成骨相关的生长因子，以及受趋化后增殖的以及血管来源的生长因子。对照组早期便只有血液来源的生长因子和巨噬细胞分泌生长因子，在生长因子的质和量上都逊于实验组，因此其骨生长的量明显小于实验组(表1，表2)。

虽然血小板及其释放的生长因子在PRF的生物学上发挥了重要的作用，但对其治疗潜能起到决定性的作用还是纤维蛋白基质[13]。PRF中的纤维蛋白网的存在使得这些细胞因子在PRF的降解过程中能逐步缓慢释放，并为修复相关的细胞提供了增殖分化的场所，在组织修复过程中发挥了细胞支架的作用[14]，而且纤维蛋白基质是促进间充质干细胞移植最适合的基质载体[15]。纤维蛋白也可以促进新生血管形成，促进血液里未分化的间充质细胞向成骨细胞转变，形成骨组织。这也是本研究中对照组骨生长的量明显小于实验组的又一原因。

综上所述，PRF的应用能够有效恢复种植体颊侧的骨缺损，表明PRF可以单独作为骨充填材料修复种植体周围骨缺损；种植体远中骨缺损修复情况表明，PRF作为独立的骨充填材料修复的新骨与正常骨无明显差异；在拔牙窝处加入PRF或明胶海绵[16]，均可促进拔牙创软硬组织的愈合，但PRF促进骨形成效果更佳。

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