凹叶厚朴抑制α-糖苷酶与抗氧化活性研究

曹乃锋，康文艺

1河南大学中药研究所;2河南大学研究生院，开封475004

凹叶厚朴 (Magnolia Officinalis Rehder et Wils.)为木兰科木兰属植物，药用干皮、枝皮及根皮。其性温、味苦、辛。具燥湿消痰、下气除满之功效，用于湿滞伤中、脱痞吐泻、食积气滞、腹胀便秘、痰饮喘咳［1］。主要成分为厚朴酚 (magnolol)与和厚朴酚(honokiol)［2］，包括异喹啉类生物碱以及挥发油［3-5］。Lee等［6］2009年报道了厚朴正丁醇提取物和4-O-甲基和厚朴酚具有抗氧化和保护神经的作用;Choi等［7］2009年报道了厚朴酚通过激活PPARr配体来提高胰岛素的敏感性;Park J等［8］报道了厚朴具有广谱抗菌等作用;Young Sook Kim等［9］通过研究发现高糖和S100b蛋白可诱导TGF-β1和纤维连接蛋白的表达，但厚朴酚能通过人体视网膜色素上皮细胞的ERK/MAPK/AKt信号通道来抑制这种增强的表达。Kenji I等［10］研究发现和厚朴酚在骨髓的微环境内能够抑制血管形成，并且能够杀死耐药的多发性骨髓瘤细胞。

本文对贵州与河南产凹叶厚朴抑制α-葡萄糖苷酶活性和总抗氧化能力进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

凹叶厚朴分别于2008年7月采集于河南省桐柏山，2009年7月采集于贵州省贵阳市。分别经河南大学天然药物研究所生药教研室李昌勤副教授和贵阳中医学院刘凡教授鉴定为木兰科木兰属植物Magnolia Officinalis Rehder et Wils，标本存于河南大学中药研究所。

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，EC 3.2.1.20);4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG，026K1516);阿卡波糖(Acarbose，Lot 16869)和二甲亚砜(DMSO)均购自美国Sigma公司。DPPH(日本东京化成工业株式会社)，ABTS(Fluka)，Fe3+-三吡啶三哑嗪(tripyridyl-triazine，TPTZ)、没食子酸丙酯(propyl gallate，PG)、丁基羟基茴香醚(Butylatedhydr oxyanisole，BHA)、二丁基羟基甲苯(Butylatedhydr oxyt oluene或2，6-Ditert-butyl-4-methyl phenol，BHT)(Acros organics)，6-羟基2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸 (6-hydroloxy-2，5，7，8-tetramethyl-chroman-2-carboxylic acid，Tr olox)(Aldrich)。

1.2 仪器

Multiskan MK3酶标仪(美国Thermo Electron公司);LRH-150恒温培养箱(上海一恒科技有限公司);DELTA 320型PH计(美国Mettler-Toledo公司)。

1.3 凹叶厚朴浸膏的提取

贵州产凹叶厚朴叶325 g和河南产凹叶厚朴叶202 g分别干燥、粉碎后，用甲醇室温下冷浸3次，每次7天。合并提取液后浓缩，浸膏分散水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到石油醚提取物8.6和4.1 g、乙酸乙酯提取物12.5和6.1 g、正丁醇提取物12.5和10.7 g。

1.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性的筛选方法

以康文艺等［11］建立的96微孔板筛选方法，405 nm处检测其OD值。并按照以下公式求出酶活性抑制率。

然后用Origin软件，以质量浓度为横轴，抑制率为纵轴作图，求出相应的半数抑制浓度(IC50值)。

1.5 抗氧化活性测定方法

DPPH法:按照文献［12］的方法，在 515 nm处检测样品吸光度;ABTS法:按照文献［13］的方法，在734 nm处检测样品吸光度;FRAP法:按照文献［12］的方法，在 593 nm处检测样品吸光度，结果以 c (Trolox)表示。

2 结果与讨论

2.1 贵州与河南产凹叶厚朴α-葡萄糖苷酶抑制活性

2.1.1 提取物活性的筛选

所有提取部位中，贵州产凹叶厚朴叶乙酸乙酯的α-葡萄糖苷酶的抑制活性最高(IC50=7.22 μg/ mL)，其正丁醇提取部位(IC50=36.59 μg/mL)、河南产凹叶厚朴石油醚部位(IC50=107.04 μg/mL)和乙酸乙酯部位(IC50=17.17 μg/mL)的活性均高于阳性对照Acarbose(IC50=1081.27 μg/mL)。

2.1.2 提取物浓度对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

图1显示，凹叶厚朴提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性呈剂量依赖性，而且，当抑制率达到一定程度时，再增加提取物质量浓度，抑制活性不会提高。其中，贵州产凹叶厚朴乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在0.4 mg/mL时，达到最大抑制率，再增加提取物浓度，抑制率不再变化。河南产凹叶厚朴石油醚提取物和乙酸乙酯提取物在0.8 mg/mL时达到最大抑制率。

图1 提取物浓度对α-葡萄糖苷酶活性的影响Fig.1 The mass concentration of extracts effect on α-glucosidase inhibitory activity

2.2 贵州与河南产凹叶厚朴抗氧化活性

2.2.1 DPPH法

凹叶厚朴6个提取部位中，石油醚部位(河南)清除DPPH自由基的能力最强 (IC50=13.63 μg/ mL)，乙酸乙酯部位(贵州)次之(IC50=13.74 μg/ mL)。河南与贵州产凹叶厚朴提取部位与阳性对照PG、BHA、BHT对 DPPH自由基的清除能力顺序为:PG(IC50=0.81 μg/mL)＞BHA(IC50=2.28 μg/mL)＞BHT(IC50=3.69 μg/mL)＞正丁醇部位(河南)(IC50=13.63 μg/mL)＞乙酸乙酯部位(贵州)(IC50=13.74 μg/mL)＞乙酸乙酯部位(河南)(IC50=20.21 μg/mL)＞正丁醇部位(贵州)(IC50=44.49 μg/mL)。

图2显示，河南产凹叶厚朴正丁醇提取物清除DPPH自由基的能力强于贵州产凹叶厚朴正丁醇提取物;河南产凹叶厚朴乙酸乙酯提取物清除DPPH自由基的能力与贵州产凹叶厚朴乙酸乙酯提取物能力相当;但弱于阳性对照PG、BHA和BHT。在实验浓度范围内，河南和贵州产凹叶厚朴乙酸乙酯提取物质量浓度在25 μg/mL以下时，DPPH自由基清除率随质量浓度增大几乎呈线性增加，当质量浓度在25 μg/mL以上时，清除率几乎不变。贵州和河南产凹叶厚朴乙酸乙酯提取物清除DPPH自由基的能力与其浓度呈线性关系(相关系数分别为0.99765和0.99552)。

图2 抗氧化剂质量浓度对DPPH自由基的影响Fig.2 Effect of mass concentration of antioxidant on DPPH free radical

2.2.2 ABTS法

乙酸乙酯部位(贵州)清除ABTS自由基的能力最强(IC50=8.81 μg/mL)。河南与贵州产凹叶厚朴提取物与阳性对照PG、BHA、BHT对ABTS自由基的清除能力顺序为:PG(IC50=0.74 μg/mL)＞BHA(IC50=2.28 μg/mL)＞乙酸乙酯部位(贵州)(IC50=8.81 μg/mL)＞BHT(IC50=11.94 μg/mL)＞乙酸乙酯部位(河南)(IC50=12.73 μg/mL)＞正丁醇部位(河南)(IC50=15.72 μg/ mL)＞正丁醇部位(贵州)(IC50=29.12 μg/mL)。

图3显示，在实验浓度范围内，乙酸乙酯提取物(贵州)清除ABTS自由基的能力最强。在质量浓度为25 μg/mL时，清除率已达到100%且清除ABTS自由基的能力与其浓度呈正量效关系 (r= 0.98979);在相同质量浓度下，乙酸乙酯提取物(河南)和PG清除ABTS自由基的能力相近，并且与其浓度呈线性关系 (相关系数分别为 0.99557和0.99854);正丁醇提取物(河南)在质量浓度为25 μg/mL以下时，ABTS自由基清除率随质量浓度增大几乎呈线性增加(r=0.9769)，在25 μg/mL以上时，清除率趋于平缓。

图3 抗氧化剂质量浓度对ABTS自由基的影响Fig.3 Effect of mass concentration of antioxidant on ABTS free radical

2.2.3 FRAP(铁离子还原能力)法

提取部位与阳性对照PG、BHA、BHT还原Fe3+能力顺序为:PG(FRAP值=16330.04 μmolTE/g)＞PHA(FRAP值=8040.13 μmolTE/g)＞BHT (FRAP值=2372.34 μmolTE/g)＞乙酸乙酯提取物(贵州)(FRAP值=952.15 μmolTE/g)＞乙酸乙酯提取物(河南)(FRAP值=856.67 μmolTE/g)＞正丁醇提取物(河南)(FRAP值 =952.15 μmolTE/g)＞正丁醇提取物(贵州)(FRAP值= 356.53 μmolTE/g)＞石油醚提取物(河南)(FRAP值=131.25 μmolTE/g)＞石油醚提取物(贵州) (FRAP值=121.03 μmolTE/g)。表明乙酸乙酯提取物(贵州)还原Fe3+的能力最强(FRAP值=952.15 μmolTE/g);其次为乙酸乙酯提取物(河南) (FRAP值=856.67 μmol TE/g)。

3 结论

首次对凹叶厚朴的α-葡萄糖苷酶抑制活性研究，发现贵州产凹叶厚朴乙酸乙酯提取部位α-葡萄糖苷酶抑制活性最好。就产地而言，贵州产凹叶厚朴乙酸乙酯提取部位和正丁醇提取部位的α-葡萄糖苷酶抑制活性高于河南产凹叶厚朴乙酸乙酯提取部位和正丁醇提取部位。

对凹叶厚朴体外抗氧化活性进行考察，发现贵州产凹叶厚朴乙酸乙酯提取部位还原Fe3+能力最强，河南产凹叶厚朴乙酸乙酯提取部位次之。就产地而言，贵州产凹叶厚朴乙酸乙酯提取部位清除DPPH、ABTS自由基的能力和还原Fe3+能力均好于河南产的;但河南产凹叶厚朴正丁醇提取部位清除DPPH、ABTS自由基的能力和还原Fe3+能力均高于贵州产的。

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