巨尾桉叶中皂苷的提取分离及其抗氧化活性研究

黄 增，刘雄民，黄丽葵，陈华玲，黄红铭

广西大学化学化工学院，南宁530004

桉树属树种有900余种，其中巨尾桉(Eucalyptus grandis x E.urophylla)是巨桉和尾叶桉杂交的速生树种，为我国主要种植树种之一。桉属植物有效成分的研究集中在挥发油成分［1-3］。亦有文献［4］指出，蓝桉等多种桉属植物中含有三萜类皂苷。陈婷等［5］对桉叶中抗菌有效部位进行了初步研究，陈海等［6］指出桉叶中多酚具有抗氧化性。但有关巨尾桉叶中皂苷的提取纯化工艺仍未受到足够重视。本文以水为溶剂，开展从巨尾桉叶中提取纯化皂苷的工艺研究，探讨提取物中皂苷的含量对抗氧化性的影响，为巨尾桉叶的开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

巨尾桉桉叶:采摘于广西大学校园。

齐墩果酸、石油醚、抗坏血酸、双氧水、三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚、二苯基苦基肼自由基(DPPH)、浓盐酸等，以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司); UV-2550紫外可见分光光度计(日本岛津公司)等。

1.3 实验方法

1.3.1 皂苷的提取

新鲜桉叶经水洗烘干后粉碎，过60目筛。称取一定量的原料，用适量石油醚在70℃水浴中回流3 h脱除叶绿素，自然挥发溶剂至干，加入适量水，于一定温度条件下浸提后，离心，上层清液用紫外可见分光光度计测定吸光度，将提取液浓缩后干燥，得到皂苷粗提物。

1.3.2 皂苷的分离纯化

1.3.2.1 有机溶剂萃取法纯化

将粗提液用旋转蒸发仪浓缩，用等体积的乙醚溶液萃取3次，水饱和的正丁醇萃取6次，将上层正丁醇相合并并且浓缩，得到皂苷纯化液，测定皂苷含量。

1.3.2.2 大孔树脂吸附法分离纯化

通过静态吸附实验，筛选出对皂苷具有较好纯化效果的HPD300型树脂，称取100 g经过预处理的HPD300型树脂，湿法装柱，室温下将浓度为6.76 mg/mL的粗提液以1.00 mL/min的流速通过大孔树脂柱，待树脂吸附饱和后，用蒸馏水洗柱至流出液无色，用2倍上样量体积的90%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，测定含量。

1.3.2.3 大孔树脂-丙酮沉淀联用分离法

对粗提液进行离心后，过0.50 μm膜进行大孔树脂上柱前预处理。称取100 g经过预处理的HPD300型树脂，湿法装柱，室温下将浓度为6.76 mg/mL的提取液以1.00 mL/min的流速通过大孔树脂柱，树脂吸附饱和后，蒸馏水洗柱至流出液无色，用2倍上样量体积的70%乙醇洗脱，减压浓缩洗脱液，再加以少量的甲醇溶解，缓慢加入丙酮，将产生的沉淀离心后弃取上层清液，多次沉淀直到上清液基本无色。用适量去离子水溶解，干燥即可回收纯度较高的皂苷。

1.3.3 皂苷的分析方法

1.3.3.1 皂苷的定性分析方法

采用皂苷的泡沫反应、与乙酸酐-浓硫酸的颜色反应、紫外可见吸收光谱和液相色谱进行检测分析。

1.3.3.2 皂苷含量的测定

按文献［7］的方法，采用香草醛-高氯酸显色分光光度法，以A548nm对齐墩果酸浓度(X)进行线性回归分析，求得线性方程为Y=2847.7X-0.0326，相关系数R2=0.9989。取一定体积的皂苷提取液按该方法测定吸光值，用线性方程计算提取液中皂苷含量。

1.3.4 皂苷的抗氧化性能

配制一定皂苷浓度的桉叶粗提液、大孔树脂纯化液和大孔树脂吸附-丙酮沉淀纯化液，同时以抗坏血酸(VC)作为对比液。按照文献［8］的方法，分别测定各溶液对DPPH自由基、过氧化氢以及超氧阴离子自由基的清除作用。

2 结果与分析

2.1 巨尾桉叶中皂苷的定性分析

2.1.1 皂苷的泡沫反应［9］

取样品适量，加入少量水溶解并煮沸10 min左右，将提取液于试管中强烈振摇，提取液有蜂窝状泡沫产生，并持续15 min以上，而空白对照液产生的泡沫在1 min内消失，该实验现象表明存在皂苷。

2.1.2 皂苷的颜色反应［10］

取样品适量，溶于乙酐中，缓慢滴加1滴浓硫酸，观察到溶液由黄色变成红色，之后变成浅绿色，最后逐渐褪去颜色，该实验现象表明存在三萜类皂苷。

2.1.3 皂苷的紫外可见光谱及液相色谱特性

图1 试样的紫外可见光(a)及HPLC(b)色谱分析图谱Fig.1 UV absorption(a)and HPLC(b)spectrum of samples

紫外可见光光谱如图1(a)所示。经过香草醛-高氯酸显色后，齐墩果酸标准品与纯化样品在548 nm处均有较强吸收。液相色谱特性如图1(b)所示，在色谱检测条件为:色谱柱Kromasil-100A C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇:水=95∶5，检测波长210 nm，流速0.80 mL/min，柱温30℃。此条件下齐墩果酸标准品与样品出峰时间基本一致，推断样品中可能有三萜类皂苷物质。

2.2 提取条件对皂苷得率的影响

2.2.1 提取温度对皂苷得率的影响

称取10 g经预处理的桉叶粉，加入适量水使得液料比为20∶1，设置提取时间为6 h。考察温度分别在30、40、50、60和70℃下对皂苷得率的影响。由图2(a)可知，随着温度的升高，皂苷的得率增大。这是因为温度升高使得分子的热运动加剧，细胞壁受到破坏致使内部的皂苷浸出。为避免消耗更多能量，提取温度以60℃为宜。

2.2.2 提取时间对皂苷得率的影响

称取10 g经预处理的桉叶粉，加入适量水使得液料比为20∶1，设置提取温度为60℃，考察提取时间分别在2、3、4、5和6 h下对皂苷得率的影响。由图2(b)可知，随着提取时间的增加，皂苷得率逐渐增大，之后皂苷的得率几乎不变，这可能是由于一方面皂苷在提取5 h已经充分溶出了。另一方面，随着提取时间的延长，皂苷可能少部分降解了。综合考虑，浸提时间选择为5 h。

2.2.3 提取液料比对皂苷得率的影响

称取10 g经预处理的桉叶粉，设置提取温度60℃，提取时间为5 h，考察提取液料比分别为12∶1、16∶1、20∶1、24∶1和28∶1下对皂苷提取得率的影响。由图2(c)可知。随着液料比的增大，皂苷的溶出率也在增大。当液固比大于20∶1时，皂苷得率增加幅度不大。从保证提取效果和降低浓缩负荷方面综合考虑，液料比以20∶1为宜。

图2 提取温度(a)、提取时间(b)、液料比(c)对巨尾桉皂苷得率的影响Fig.2 The effect of extraction time(a)，extraction temperature(b)and ratio of liquid to solid(c)on yield of saponin

2.3 响应面法优化回流提取的工艺

根据Box-Behnken中心组合实验设计原理，通过单因素试验，选取提取温度、提取时间、提取液料比这3个对桉叶皂苷得率影响较为显著的因素，采用三因素三水平的响应面分析方法优化皂苷的提取工艺，如表1所示。

表1 Box-Behnken设计实验因素水平及编码Table 1 Factor level and coded of Box-Behnken design

表2 Box-Behnken实验设计方案及实验结果Table 2 Box-Behnken design matrix and response value for the yield of saponin

1 1 0 -1 1 4.0 5 1 2 0 1 1 4.1 0 1 3 0 0 0 5.5 5 1 4 0 0 0 5.6 0 1 5 0 0 0 5.4 2 1 6 0 0 0 5.4 0 1 7 0 0 0 5.5 1

以皂苷得率为响应值(Y)，响应面试验设计与试验结果见表2。试验中，1～12是析因试验;13～ 17是中心点重复试验用来估计试验误差。

应用Design Expert软件，对表2中的数据进行多元回归拟合，选择对响应值显著的各项，可得桉树叶水提液中皂苷的得率对提取温度、提取时间和料液比的二次多项回归方程为:Y=5.500+0.160A+ 0.025B+0.061C+0.025AB+0.003AC+0.025BC-0.450A2-0.750B2-0.720C2。

对回归方程进行方差分析和显著性检验，桉树叶水提液中皂苷提取回归分析结果见表3。

表3 回归模型方差分析结果Table 3 ANOVA for the response surface quadratic polynomial model

对回归方程进行检验，相关系数R2=0.9942，P＜0.0001，表明回归模型显著，拟和程度好。对系数进行显著性检验(表3)，由F值可判定对指标影响的显著性依次为A＞C＞B即温度＞料液比＞时间，优化后得到的最佳工艺条件为:提取温度61.81℃、提取时间5.02 h，液料比为20.09∶1，在此条件下桉叶中皂苷的得率为5.51%。

2.4 巨尾桉叶中的皂苷分离纯化结果

表4 三种不同分离纯化方法的纯化效果Table 4 The purification effect comparison of different methods

由表4可知，经有机溶剂萃取纯化后，桉叶中皂苷的含量由16.22%提高到20.11%。其回收率为54.34%，此方法需要消耗较多的溶剂，纯化周期较长，但纯度较低。经过HPD300树脂一次纯化后可得到为含量为 31.64%的皂苷，其回收率为72.18%，周期较短，回收率也较高，但纯度较低。而采用大孔树脂-丙酮沉淀联用分离法可得到为含量为50.35%的皂苷，其回收率为65.41%，纯度较高。

2.5 皂苷抗氧化性质研究

2.5.1 皂苷清除DPPH自由基的测定

为确定各试样对DPPH·的清除效果，考察各试样在0.01至0.60 mg/mL浓度范围内的清除率。由图3(a)可知，在较低浓度时，抗坏血酸、粗提物、大孔树脂纯化物和大孔树脂吸附-丙酮沉淀纯化物对DPPH·均有较高的清除率。在实验浓度范围内，粗提物和大孔树脂纯化物均在浓度为0.50 mg/ mL时有最大清除率，分别为83.02%和84.20%。大孔树脂吸附-丙酮沉淀纯化物在浓度为0.60 mg/ mL时有最大清除率，为85.62%。

2.5.2 皂苷清除过氧化氢(H2O2)的测定

为确定各试样对H2O2的清除效果，考察各试样在0.01至0.50 mg/mL浓度范围内对H2O2的清除率。由图3(b)结果可知，粗提物对H2O2的清除效果较明显，两种纯化物对H2O2的清除效果稍低。在实验浓度范围内，粗提物、大孔树脂纯化物和大孔树脂吸附-丙酮沉淀纯化物均是在浓度为0.50 mg/ mL时有最大清除率，其清除率分别为80.10%、55.02%和48.21%。

图3 不同浓度试样对DPPH·(a)、H2O2(b)和O(c)的清除曲线Fig.3 DPPH free radical(a)，Hydrogen peroxide(b)and Superoxide anion radical(c)scavenging rates of different samples

3 结论

3.1 进行了巨尾桉叶有效成分的定性鉴定，结果表明，巨尾桉叶中所含的皂苷为三萜类皂苷。

3.2 进行了皂苷提取工艺优化研究，确定提取巨尾桉叶中皂苷的较优条件为:提取温度61.81℃、提取时间5.02 h，液料比为20.09∶1，在此条件下皂苷的得率为5.51%。

3.3 对粗皂苷进行了分离纯化方法的探索，采用溶剂萃取法、大孔树脂吸附法以及大孔树脂吸附-丙酮沉淀联用分离法分别对桉叶水提液进行分离纯化，经过对比得出较优的分离方法为大孔树脂吸附-丙酮沉淀联用法。该方法可得到含量为50.35%的皂苷，其回收率为65.41%。

3.4 开展了对桉叶提取物的抗氧化性能研究，结果指出，提取物对DPPH·有明显的清除作用，随着皂苷含量的增大，对DPPH·的清除率也相应增大，但未见显著差异;在清除H2O2和O体系中，随着试样中皂苷含量的增加，试样对H2O2和O清除能力有所下降，由此可知巨尾桉中皂苷对H2O2和的清除作用不显著。

1 Tian YH(田玉红).Chemical composition，antimicrobial and antioxidative properties of volatile components from leaves of Eucalyptus growing in Guangxi.Guangxi:Guangxi University (广西大学)，PhD.2006.

2Tian YH(田玉红)，Liu XM(刘雄民)，Tao MY(陶明有)，et al.Extraction and determination of volatile constituents of leaves from E.grandis×E.urophylla.J Guangxi Acad Sci (广西科学院学报)，2006，22:466-468.

3 Liu XX(刘小香)，Chen QB(陈秋波)，Wang ZH(王真辉)，et al.Allelopathic effects of essential oil from Eucalyptus grandis×E.urophylla on pathogenic fungi and pest insects.Chin J Ecol(生态学杂志)，2007，26:835-839.

4 Fu WW(付文卫)，Zhao CJ(赵春杰)，Pei YP(裴玉萍)，et al.Studies on the chemical constituents and biologic activies of Eucalyptus.World Phytomed(国外医药:植物药分册)，2003，18(2):51-58.

5 Chen T(陈婷)，Lin HY(林红英)，Zhang JD(张继东).A-nalysis of the antibacterial effective parts and active components in G9 Eucalyptus leaves.J Tradit Chin Vet Med(中兽医医药杂志)，2010，29(2):5-7.

6 Chen H(陈海)，Tian H(田宏)，Xiao SY(肖苏尧)，et al. Research on extraction of antioxidants and antioxidant properties of Eucalyptus leaves.Hunan Forest Sci Technol(湖南林业科技)，2009，36(2):25-29.

7Tang QT(唐青涛)，Qiu HY(邱海燕)，Liao WL(廖伟玲)，et al.Determination of total saponins in pericarps of Sapindus mukorossi Caertn by spectrophotometry.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2008，20(suppl):84-86.

8 Liang QX(梁秋霞).Study on the extraction technology and bioactivity of effective components from Cinnamon.Guangxi: Guangxi University(广西大学)，PhD.2010.

9 Dong WC(董万超)，Sun X(孙先)，Liu CH(刘春华)，et al.Comparative studies on saponines from germplasm resource of Ginseng.Pri J Chin Mater Med(基层中药杂志)，2001，2:3-6.

10 Lu WL(禄文林)，Li XX(李秀信).Study on extraction of Toona sinensis saponins and antibacterial activity.J Inner Mongolia Agric Univ(内蒙古农业大学学报)，2008，29: 227-229.