乳源性寡糖对仔猪肠道健康的影响及母猪乳腺合成寡糖的生化机制

杨雪芬 熊光源 周桂莲 林映才 蒋宗勇*

(1.广东省农业科学院畜牧研究所，农业部动物营养与饲料(华南)重点开放实验室，广东省动物育种与营养公共实验室，广州 510640;2.贵州省凯里市畜牧兽医局，凯里 556000)

肠道和皮肤表面菌群数量比人体和动物体细胞还要多，据估测为10倍［1］。肠道定植有大量的微生物，它作为机体与微生物接触最密集的界面，免疫活动异常剧烈。与此相对应，肠道聚集的T淋巴细胞数超过机体总数的50%。因而，肠道菌群数量和结构是维持肠道健康和动物生长性能的关键因素。因此，有必要弄清楚新生仔猪肠道菌群是如何建立及母乳中是否存在促进有益菌的快速增殖因子，以保护幼畜。研究发现，乳汁中含有的寡糖可作为乳酸菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)唯一碳源(即专嗜性)而促使它们快速增殖［2-3］。本文从这一角度出发，试图阐明母畜通过乳源性寡糖帮助幼畜肠道乳酸菌和双歧杆菌快速定植，进而抑制有害菌繁殖，调节肠道菌群发育，调节肠道免疫发育和免疫耐受，最终保护幼畜。

1 乳寡糖的种类

目前，尚不知猪乳汁中乳寡糖的含量。人初乳中寡糖含量较高，为20～23 g/L，常乳为7～12 g/L。猪乳与牛乳含有的寡糖相似，分别为29种和40种，但却远比人乳寡糖种类(130种)少，原因是人乳寡糖的同分异构体很多，有些多达8种，而猪乳和牛乳很少或基本上没有［4］。并且在猪乳中，酸性与中性乳寡糖的比例为70∶20，这与牛乳相似，而与人乳刚好相反。酸性乳寡糖大多是在寡糖的非还原性末端被唾液酸化，包括N-酰基神经氨酸(N-acetylneuraminic acid，NeuNAc)和N-糖基神经酸(N-glycolylneuraminic acid，NeuGc)的寡糖，而中性寡糖非还原性末端则是海藻糖(L-fucose，Fuc)、半乳糖(D-galactose，Gal)、葡萄糖(D-glucose，Glc)、N-酰基糖胺(N-acetylglucosamine，GlcNAc)、和 N- 酰基半乳糖(N-acetylgalactosamine，GalNAc)化的寡糖。目前鉴定，组成乳寡糖的基本单元有乳糖、Fuc、Gal、Glc-NAc、GalNAc、NeuNAc、NeuGc，其中，乳糖是核心单元，在此基础上以不同糖苷键形成单元数不同的乳寡糖［5］。人和家畜肠道不存在能水解三单元以上寡聚糖糖苷键的酶类，因而乳寡糖只能被肠道专嗜性的微生物如乳酸菌和双歧杆菌等所利用。

2 乳寡糖调节新生仔猪肠道乳酸菌和双歧杆菌定植

2.1 猪肠道微生物菌群发育

从空间角度而言，由于胃肠道前段pH较低，食糜流速较快，食糜丰富程度亦低等原因，猪胃肠道前段菌群数量要比后段少［6-7］;从时间角度来看，猪胃肠道菌群在哺乳期、断奶前期和生长肥育期亦发生显著变化［1，6-8］。1～4周龄哺乳期仔猪胃、小肠、大肠壁黏膜的优势微生物为乳酸菌、拟杆菌(Bacteroides)+梭菌(Clostridium)、链球菌(Streptococcus)，它们在小肠后段的lg CFU/g值(每克黏膜菌落形成单位的对数值)分别可达8.2、7.4、6.8，而肠球菌、葡萄球菌、肠杆菌和大肠杆菌(E.coli)数量较少。从前至后肠道内各微生物菌群数量增加，但从胃至小肠前段，乳酸菌所占比例较为稳定，约为60%，而拟杆菌+梭菌比例有所增加，即从胃的8%增至大肠前段的23%。在4～8周龄的断奶期，胃肠道各段黏膜各菌群急剧下降，其中，乳酸菌降至25%，而拟杆菌 +梭菌降至13%［6］。在断奶期，随着有害菌大肠杆菌的增加，肠道各段有益菌乳酸菌所占比例降低［8］。超早期断奶(2日龄)仔猪在15日龄时盲肠内容物中乳酸菌比例仅为 10%［9］。

Leser等［7］检测了肠道菌群的16S rDNA后得知，12～18周龄的生长肥育猪回肠、盲肠、大肠食糜的菌群数量分别为86、231、298，Shannon-Wiener值(反映多样性)分别为 4.65、6.78、6.90，显示出菌群种类在肠道空间上的渐变性。肠道主要菌群及比例大致为:优杆菌(Eubacterium)33%、梭菌29%、乳酸菌 +链球菌12.3%、鼠孢菌(Sporomusa)4%(前均属厚壁菌门)、屈挠杆菌(Flexibacter)+噬胞菌(Cytophaga)+拟杆菌(Bacteroides)(属拟杆菌门)11.2%、变形杆菌(Proteobacteria)(属变形体门)5.3%、支原体(Mycoplasma)(属柔膜菌门)2.1%、高胸腺嘧啶+胞嘧啶(G+C)菌 1.1%、螺旋体菌(Spirochetes)0.5%(属螺旋体门)。类似的方法也用于分析猪粪便中微生物区系以反映大肠菌群变化。最近，Kim等［1］采用高通量DNA测序法分析了10～22周龄生长肥育猪粪便中的微生物区系，结果显示，猪大肠微生物区系主要由厚壁菌门(一类低G+C革兰氏阳性菌)和拟杆菌门组成，两者所占总菌数的比例为90%左右，其他如变形菌门、放线菌门(双歧杆菌属于此门)、螺线体门、混杂门比例均小于1%，未分类菌群则约占10%。从10～13周龄，厚壁菌门菌群比例从60%提高至70%左右，22周龄时提高至80%;相反，拟杆菌门菌群随年龄降低，从10周龄时的35%左右降至22周龄10%。其中，厚壁菌门中梭菌纲和芽孢杆菌纲比例在10～22周龄的变化趋势分别为40%→67%和18%→9%;拟杆菌门主要由拟杆菌纲菌群组成，变化趋势为33%→10%，而黄杆菌纲和鞘脂杆菌纲菌群很少(＜1%)。在厚壁菌门菌群中，非产气菌(Anaerobacter)变化最大，从10周龄的0.6%增至22周龄的24.3%，有类似变化趋势的主要菌群(试验期平均比例大于1%)还有优杆菌(0.4%→8.0%)、颤 杆 菌 克 (Oscillibacter)(1.4%→2.4%)、八叠球菌(Sarcina)(0.1% →3.6%);随周龄而降低的菌群有:乳酸菌(11.0%→3.1%)、巨型球菌(Megasphaera)(5.9%→0.2%)、梭菌科Subdoligranulum(2.9% →0.7%)、复数菌(Blautia)(3.0% →0.9%)、梭 菌 科 Faecalibacterium(2.8%→ 0.2%)、假 丁 酸 弧 菌 (Pseudobutyrivibrio)(2.3%→0.4%)、韦荣氏菌科 Dialister(2.3%→0.2%);从10周龄到16周龄再到22周龄先增高后降低的有:链球菌(4.6%→9.5%→4.2%)、粪球菌(3.2% →5.6% →4.6%)、毛螺旋菌科 Roseburia(0.7%→1.8%→1.3%)。在拟杆菌纲的菌种(或属)中，普氏菌(Prevotella)最为丰富，其变化趋势为 26.1% →3.8%［1］。值得一提的是，双歧杆菌(属于放线菌门)的数量仅占0.1% ～0.3%。还有利用变性高效液相色谱法、末端限制性片段长度多态性法［10］和实时 PCR 法［11］分析生长肥育猪粪便中微生物区系，结果显示大肠主要菌群为厚壁菌门和拟杆菌门。目前，尚不清楚这2类菌群在哺乳期、断奶期猪大肠的发育模式。鉴于它们的时空发育关系［1］，可推测厚壁菌和拟杆菌菌群可定植于新生仔猪肠壁上，按照有关评价标准，它们应归类为猪肠道的正常菌群。最近发现，猪大肠拟杆菌纲菌群数量与背膘厚呈负相关关系(R2=0.63)，而梅山猪大肠中拟杆菌数量比“杜×长×大”三元杂交猪少，这至少部分地解释了梅山猪有较高体脂这一现象［11］。这也暗示了肠道各菌群有不同营养功能。反过来讲，幼龄猪肠道较高比例的拟杆菌菌群是否与机体蛋白质沉积有关，仍有待于研究证实。

2.2 乳寡糖促进新生期猪肠道乳酸菌和双歧杆菌的定植

当前，鲜有研究直接证实乳寡糖可影响新生猪肠道正常菌群如厚壁门和拟杆菌门菌群在早期的定植。不过，据推测，乳寡糖是哺乳期乳酸菌(属于厚壁菌门)和双歧杆菌(属于放线菌门)定植于肠道，并减少大肠杆菌、沙门氏菌和轮状病毒等致病微生物繁殖的一个重要营养因素。第一，乳酸菌是哺乳仔猪小肠和大肠的绝对优势菌群，而大肠杆菌比例极低［6］;第二，由于饲粮结构的变化，猪肠道各段乳酸菌和双歧杆菌数量和比例是随日龄增长而降低，提示它们对寡糖有专嗜性，不过，乳酸菌在成年猪小肠各段比例仍大于20%［6］;第三，在哺乳期，人大肠中乳酸菌和双歧杆菌为主要优势菌群，而在1周岁时，人肠道菌群［12］与生长猪的相似［1］;第四，初乳中的寡糖含量很高，常乳相对较低，暗示新生动物肠道急需快速建立有益微生物菌群，尤其是乳酸菌和双歧杆菌［5，13］。这也从另一方面说明，乳寡糖的缺失应为断奶后猪肠道乳酸菌和双歧杆菌数量和比例降低的一个主要因素［8-9］。全基因组序列分析显示，长双歧杆菌(B.longum)比婴儿双歧杆菌(B.infantis)含有更多利用植物性碳水化合物的基因，相反后者含有更多利用乳寡糖的基因，可见B.infantis更能适应哺乳期的肠道环境，而 B.longum更适合成年期［12］。代谢结果也同样证实，B.infantis能利用纯化的乳寡糖作为唯一的碳源，而格氏乳杆菌(L.gasseri)却不能［2］，但嗜酸乳酸杆菌(L.acidophilus)能以低聚半乳糖作为唯一碳源，原因是在其长度为16.6 kbp的gal-lac基因簇中，存在GPH(galactoside-pentose-hexuronide)透膜酶，此酶基因在低聚半乳糖存在时表达量提高5.1倍，显示其在菌体具有利用寡糖的作用［3］。这些研究表明，乳汁寡糖是母体保护幼畜的一个重要机制，它可选择特定的双歧杆菌和乳酸菌在肠道定植［3，5，13］。肠道在早期附着的双歧杆菌和乳酸发挥着重要的营养生理功能，如影响后期菌群模式［14-15］，抑制病原菌的定植［3，6，8］，调节肠道黏膜免疫发育等［16-18］。

3 乳寡糖在肠道健康中的作用

3.1 肠道早期菌群定植影响后期菌群模式

研究报道，给新生婴儿饲喂含有8 g/L寡聚糖(半乳寡聚糖:果寡聚糖=9∶1)奶粉6个月，发现3月龄和6月龄时粪便中乳酸菌和双歧杆菌数量显著增加，pH显著降低，有意思的是，12月龄时，这种效应仍然存在，这提示早期菌群定植模式有一种“印记效应”，即肠道早期菌群定植可影响后期菌群模式［14］。与此类似，母乳喂养的婴儿肠道双歧杆菌数量比奶粉喂养的在种类和数量都要多，且这种效应在18月龄仍可检测［15］。虽然在猪的研究上，尚未见类似的“印记效应”，但根据猪和人的肠道菌群模式发育特点的相似性［1，12］，仍可假设猪肠道菌群亦存在这种效应。因此有必要就此作深入的探究。

3.2 哺乳期双歧杆菌和乳酸菌抑制病原菌作用

许多乳酸菌和双歧杆菌可产生杀菌素，这些杀菌素多数具有杀灭包括致病性大肠杆菌在内的病原菌的效应(表1)。因此，新生动物肠道需要乳酸菌和双歧杆菌快速定植，以抑制病原菌繁殖而保护新生动物［5，13］。断奶显著减少了仔猪肠道乳酸菌等有益菌群，而增加大肠杆菌等致病性细菌数量［3，6，8］，其中一个重要原因可能是仔猪从饲粮获得的寡糖比乳汁少［5］。然而，关于乳酸菌和双歧杆菌产生的杀菌素为动物提供保护这一机制说法多为推测，尚缺乏直接的体内研究证据。最近，Fukuda等［29］报道，双歧杆菌 B.longum 保护无菌鼠免受感染大肠杆菌O157(E.coli O157)攻击致死的作用至少部分是由B.longum本身产生乙酸而发挥的，因为乙酸有降低E.coli O157的毒力作用，如敲除B.longum的ABC型碳水化合物转运载体(ABC-type carbohydrate transporters)基因，菌体则失去保护作用，表明此转运载体在合成乙酸中的作用。可见，益生菌或共生菌产生的保护作用至少包括杀菌素和短链脂肪酸。除产生杀菌物质外，乳酸菌和双歧杆菌亦可通过对病原菌的黏附抑制、对黏附位点置换和竞争等作用，维持肠道菌群正常生理功能。

3.3 哺乳期双歧杆菌和乳酸菌在介导肠道黏膜免疫发育的作用

3.3.1 猪肠道黏膜免疫发育

猪肠道黏膜是自身免疫系统与外界环境的一个复杂界面，其免疫系统包括肠道物理屏障、先天性免疫系统、获得性免疫系统和被动免疫(哺乳期由母乳提供免疫球蛋白而获得)。在此，主要讨论猪先天性免疫系统和获得性免疫系统的发育。

表1 乳酸菌和双歧杆菌产生的杀菌素的一些重要特性Table 1 Important characteristics of the purified bacteriocins produced by Lactobacillus and Bifidobacterium

3.3.1.1 先天性免疫系统的发育

先天性免疫系统参与的免疫细胞有自然杀伤细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等粒细胞，这些粒细胞大部分由骨髓造血干细胞的骨髓淋巴细胞分化而来。其中，中性粒细胞约占粒细胞的50%。仔猪出生后，肠道一旦出现菌群的定植，首先引起单核细胞(巨噬细胞)的反应，随后依次为树突细胞和T细胞［38］，可见先天性免疫在新生动物有“维护自我”的作用。研究报道，嗜酸乳酸杆菌可增加无菌仔猪和正常饲养仔猪血液中白细胞数量，且以增加中性粒细胞为主［30］。拟干酪乳杆菌(L.paracasei)也可增加10日龄仔猪和健康断奶仔猪白细胞和中性粒细胞数量，增强它们的吞噬活性，且在配合使用果寡聚糖时亦有相同的效果［31］。然而，植物乳杆菌(L.plantarum)却抑制感染致病性大肠杆菌导致的中性粒细胞的迁移，这可能与动物的健康状态相关，目的是抑制炎症的发生［32］。Zhang等［16］分别以轮状病毒、嗜酸乳酸菌 +罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、轮状病毒+乳酸菌处理新生无菌猪，观察肠道和脾脏中树突细胞、巨噬细胞的分布和募集情况。结果发现，乳酸菌增加了肠道树突细胞和巨噬细胞数量，而轮状病毒比乳酸菌更容易募集巨噬细胞至肠道固有层处，但乳酸菌减少了轮状病毒募集巨噬细胞和树突细胞至脾脏和肠道的能力，显示出乳酸菌本身可激活新生仔猪肠道免疫机能，亦能在整体免疫层面上降低仔猪感染轮状病毒导致炎症的严重程度。此外，嗜酸乳酸杆菌可依赖树突细胞增强杀伤性细胞的杀菌活性［33］，而干酪乳杆菌(L.casei)亦有相同的作用［34］。

鲜有研究证实双歧杆菌在仔猪肠道黏膜中性粒细胞的作用。两歧双歧杆菌(B.bifidum)能增强树突细胞(肠道免疫信息的主要采集细胞)分泌趋化因子 CXC1、CXC2、CXC5的基因表达，这些细胞因子可有效募集中性粒细胞［35］。同时，B.bifidum也能以依赖树突细胞方式诱导和增强杀伤性细胞的活性［33］。动物双歧杆菌(B.animalis)能迁移至肠系膜淋巴结处，并激活巨噬细胞等免疫细胞Toll受体-2和-4基因的表达，但却下调仔猪肠系膜淋巴结致肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因表达，提示此菌种可调节先天免疫反应，但限制炎症发生［36］。

3.3.1.2 获得性免疫系统的发育

肠道获得性免疫包括体液免疫和细胞免疫，发挥这2种免疫功能的细胞巢穴为肠道淋巴结组织，因此，了解肠道淋巴结组织发育具有重要意义。哺乳动物肠道淋巴结系统包括Peyer’s结(位于小肠)、大肠结(位于大肠)、孤立淋巴滤泡、肠系膜淋巴结。最近报道，隐窝处的补丁细胞(crypopatch)是由动物出生前肠道的淋巴组织诱导细胞(lymphoid-tissue inducer cells，LTi)演化而来，其在肠道淋巴结系统发生和成熟有关键作用［37］。在胎儿期，间叶细胞膜表达趋化因子CXCl5、CXC13及相应配体CXCL，作用于LTi细胞膜上的整合因子(integrin)，将其引至淋巴结发生。同时，LTi表达淋巴毒素(lymphotoxin)α1β2，作用于间叶细胞，促使其表达更多的趋化因子，进一步诱使LTi位移和促使淋巴结发育，此为第1步“正反馈”调节;动物出生后，树突细胞替代胎儿期间叶细胞的作用，形成第2次“正反馈”调节，进一步诱导Payer’s结和大肠结发育。基因芯片结果显示，嗜酸乳酸杆菌NCFM(L.acidophilus NCFM)可选择性地诱导树突细胞表达趋化因子CXC9、CXC10、CXC11及配体 CXCL3、CXCL4、CXCL7、CXCL12 的基因表达，而两歧双歧杆菌却可提高趋化因子如CXC1、CXC2、CXC5 的基因表达［35］。这提示，乳酸菌和双歧杆菌在新生动物肠道淋巴结发育有不同促进作用。尚需更多研究证实这2种益生菌介导趋化因子在肠道淋巴结发育的精确机制。

在无菌状态下，小肠绒毛和隐窝固有层缺少树突细胞和T细胞，表明肠道微生物在介导黏膜免疫的作用［38］。如有菌群定植，肠道黏膜淋巴细胞则体现出明显的发育特征，至4周龄时，固有层T细胞增加1倍［39］;至5周龄时，迁移至上皮细胞间的T细胞占肠道黏膜 T细胞总数的50%［40］。在出生后第5天，固有层未成熟的CD2+T细胞开始分化为CD4+和CD8+T细胞亚型，至第12天时它们占CD2+T细胞的1/2［41］。但 CD8+和 CD4+并不以相同的规律发育。据报道，CD4+亚型增殖速度很快，尤其是在CD2+T细胞开始分化之后，而CD8+则是在出生后第5～7周龄期间才以较快速度增殖［39］。在24周龄时，猪肠道上皮间CD8+T细胞占总T细胞的1/2，此比例为成年猪水平。检测发现CD4+/CD8+比值亦反映出，在幼龄猪肠道此比值约为 2，而在成年猪，此比值小于 1［39，42］。这说明猪在幼年期体液免疫力较强，而在成年期细胞免疫较强，这可能是幼年期猪容易感染轮状病毒的一个重要原因。

CD8+进一步分化为辅助性Th1(细胞毒性T细胞)，参与细胞免疫，主要针对病毒抗原，而CD4+T细胞(辅助性Th2)分化为B细胞，分泌免疫球蛋白，故CD4+反映体液免疫水平。Th1/Th2平衡是传统的经典免疫模型，反映体液免疫和细胞免疫的相对活性，尽管这个模型受到越来越多的挑战。研究报道，给哺乳仔猪或断奶仔猪口服拟干酪乳杆菌或拟干酪乳杆菌+果寡糖，血液中CD2+和CD4+T细胞，以及B细胞数量显著增加，表明此乳酸菌调节了机体的获得性免疫机能［31］。唾液乳酸杆菌(L.salivarius)能增加十二指肠上皮细胞间淋巴细胞的数量，且能增加分泌免疫球蛋白A(IgA)细胞数量［17］。与此类似，两歧双歧杆菌可增加肠系膜淋巴结和Peyer’s结中分泌免疫球蛋白的B细胞数量，并诱导其合成IgA和免疫球蛋白M(IgM)，但这些免疫球蛋白并不针对两歧双歧杆菌本身，表明此菌并不引起对自身不利的免疫反应;进一步研究表明，发挥以上作用的成分存在于菌体本身，而不是其分泌的活性成分［43］。

Th1分泌干扰素(INF)-γ、致肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-2等细胞因子，而Th2则倾向于表达 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 等细胞因子，因此，测量这些细胞因子的表达水平可间接反映细胞免疫和体液免疫的相对状态。研究报道，发酵乳杆菌(L.fermentum)可增加无菌仔猪肠道前段上皮细胞间淋巴细胞数量［18］，增加普通仔猪血液中CD4+细胞数量，刺激肠道INF-γ、TNF-α的基因表达［42］。对人［44-45］、鼠［46］的研究也表明，乳酸菌可显著增加 INF-γ、TNF-α、IL-12等与 Th1相关的细胞因子生成，但抑制Th2相关细胞因子的生成［44］。INF-γ、TNF-α、IL-12 等细胞因子是多功能的致炎性因子，参与先天免疫和细胞免疫［42］。Weiss等［35］最近报道，嗜酸乳酸杆菌上调树突细胞 INF-β、TNF-α、IL-12、IL-12α/β、IL-15、IL-18 等细胞因子，这些作用可被双歧杆菌B.bifidum减弱，且后者还可上调IL-6和IL-10等细胞因子。给仔猪口服双歧杆菌B.animalis虽然使Toll样受体-2和Toll样受体-4基因表达增加，但却使肠系膜淋巴结TNF-α基因表达下降，表明双歧杆菌或可限制先天免疫和细胞免疫反应［36］。这些结果似乎暗示，乳酸菌虽然对体液免疫有一定的作用，但它们更倾向于调节先天免疫和细胞免疫，而双歧杆菌在调节体液免疫方面可能有更大作用。

3.3.2 免疫耐受

免疫耐受的介导是一个极其复杂的过程，目前尚不清楚新生动物建立免疫耐受的生化机制。许多研究证实，在健康情况下，乳酸菌［16，32］和双歧杆菌［36，42-43］可刺激肠道黏膜免疫的发育;但在感染疾病的情况下，它们却抑制致炎性细胞因子的产生，但刺激免疫抑制性细胞因子产生，如IL-10、表皮生长因子(TGF)等，随后促使T细胞向调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)转化，从而诱导免疫耐受［35］。在免疫耐受的介导过程中，肠道中郎格汉斯细胞(Langerhans cells，树突细胞的一种分型细胞)的作用不可或缺。新近的研究发现，抗原提呈状态的、激活的郎格汉斯细胞起初会进行自身增殖，但随后却未能成功促使CD4+T细胞分化为效应T细胞或记忆细胞，或使效应T细胞或记忆细胞长久存活而引起免疫反应，这是因为在激活了的郎格汉斯细胞中，核因子(NF)-κB亚基RelB未能从胞质中迁移至胞核，从而不能引发CD4+T细胞分化而引起的免疫反应［47］。这表明，肠道益生菌或共生菌与有害菌可被不同类型的树突细胞识别，从而决定肠道黏膜是否引起免疫耐受或免疫反应。López等［48］报道，双歧杆菌 B.animalis、B.bifidum、B.longum 和短双歧杆菌(B.breve)均能介导外周血单核细胞表达高水平的IL-17和低水平的 TNF-α和 INF-γ，能促使树突细胞表达较多的IL-10，提示它们能诱导Treg(亦称为Th17细胞)分化增殖。乳酸菌中植物乳杆菌、嗜酸乳酸杆菌和罗伊氏乳杆菌能抑制感染病原微生物仔猪的免疫反应，提示它们应在介导免疫耐受方面有重要作用［16，32］。

4 母猪乳腺合成寡糖的生化机理

根据对人［5］和家畜［4］乳汁寡糖的结构鉴定可知，乳腺合成寡糖均是在乳糖的基础上通过糖苷键连接而成。乳糖是由半乳糖和葡萄糖以β-1，4糖苷键组成。因此，有必要首先弄清楚乳腺合成乳糖的生化机制。

4.1 乳糖的合成

乳腺合成乳糖的机制发现于20世纪70年代。乳腺上皮细胞的高尔基体存在乳糖合成酶，此酶由β-1，4半乳糖基转移酶及调控其活性的α-乳白蛋白组成［49］。具体来说，当无α-乳白蛋白存在时，乳糖合成酶不能催化半乳糖与葡糖糖以β-1，4糖苷键形成乳糖，但可催化半乳糖与乙酰氨基葡萄糖以β-1，4糖苷键与蛋白质结合而形成糖蛋白;但当α-乳白蛋白存在时，乳糖合成酶的酶活性位点被调控，具备合成乳糖的活性。合成乳糖的所需原料为葡萄糖和磷酸尿苷-半乳糖，它们分别由高尔基体膜上葡萄糖转运载体-1(GLUT1)和二磷酸尿苷(UDP)-半乳糖转运载体从细胞质摄取。GLUT1为乳腺上皮细胞中高尔基体膜所特有，在其他细胞高尔基体膜上并不存在［49］。α-乳白蛋白的调控活性与GLUT1转运活性受泌乳生理相关激素如催乳素调节［49-50］。可见，乳腺合成乳糖受胞质中葡萄糖、UDP-半乳糖丰度及其转运载体活性、α-乳白蛋白表达量等因素的调控。

4.2 乳寡糖的合成

采用质谱和高效液相色谱法检测获知，猪乳中含有29种寡糖，主要种类有4种，包括3单元组成的寡糖 NeuNAc(α2-6)Gal(β1-4)Glc［简称:NeuNAc(α2-6)lac］，4 单元的 Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc(简称:LNT)，6单元的［Glc(β1-4)GlcNAc］2(β1-3/6)Gal(β1-4)Glc(简称:LNH)，7单元的 NeuNAc(α2-3)［Glc(β1-4)Glc-NAc］2(β1-3/6)Gal(β1-4)Glc(简称:NeuNAc-LNH)。在整个泌乳期，常乳的 NeuNAc(α2-6)lac、LNH、NeuNAc-LNH均比初乳低，但LNT则随泌乳期而增加。总的来说，NeuNAc(α2-6)lac所占乳寡糖的比例最高(＞50%)，其他各占5% ～35% 不等［4］。

在乳腺上皮细胞的高尔基体中，唾液酸转移酶(sialyltransferase)催化 NeuNAc以 α2-3/6糖苷键连接到乳糖或寡聚糖的非还原性末端上，形成酸性乳寡糖［51］。猪乳的酸性寡聚糖为 NeuNAc(α2-6)lac 和 NeuNAc-LNH［4］，猪乳腺上皮细胞合成它们可能受唾液酸丰度和及其转移酶酶活的影响。NeuNAc是唾液酸的最主要形式，由胞质利用N-乙酰基化的D-甘露糖胺(ManNAc)和D-葡糖糖胺(GlcNAc)经由5步反应合成而来，即UDP-Glc→UDP-GlcNAc→ManNAc→6-磷酸 NeuNAc→9- 磷酸 NeuNAc→CMP-NeuNAc，随后CMP-NeuNAc进入高尔基体而用于寡糖合成。

猪乳中性寡糖的主要形式是四聚寡糖LNT和六聚寡糖LNH［4］。LNT被认为是乳汁中性寡聚糖重要的核心寡糖之一，在其非还原性末端可被其他单糖连接而形成更为复杂的寡聚糖，如LNH［5］。LNT合成的第1步是在 β1-3-N-乙酰基葡糖苷转移酶(β1-3-N-acetylglucosaminyltransferase)的作用下，UDP-GlcNAc以β1-3糖苷键连接至乳糖非还原性末端上，然后再在β-D-半乳糖苷酶的作用下，生成LNT［52］。

5 小结

综上所述，母乳中寡糖是促进新生仔猪肠道乳酸菌和双歧杆菌快速定植的重要活性成分，其主要功能是抑制病原菌，调节后期肠道菌群模式和黏膜免疫发育，从而有利于新生仔猪的健康生长。肠道健康是当前动物营养领域研究的一个重要热点，而肠道菌群是影响肠道健康的最为重要因素之一。肠道菌群的先天建立可影响后天菌群，因而，影响后期动物生长、繁殖、健康等与生产相关指标。为此，结合质谱、色谱分析法，分离纯化并探讨特定种类寡糖是否具有促进特定菌群生长的作用。其次，利用现代分子生物学方法如高通量DNA测序法动态监测不同品种、不同生理状态条件下猪胃肠道菌群在时间、空间的发育性变化，以及寡糖在其中的调节作用。此外，需进一步弄清楚益生菌调节肠道黏膜免疫反应与有害菌的差别的分子机制。再者，有必要探讨乳腺合成寡糖的调控方法和研究寡糖对新生仔猪的早期营养。

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