香草酸对青钱柳离体胚萌发过程中生理生化指标的影响及各指标的相关性分析

尚旭岚，徐锡增，方升佐

(南京林业大学森林资源与环境学院，江苏南京210037)

酚酸是指带有酚类基团的有机酸，是植物在生命活动过程中产生的一类重要次生代谢产物，也是植物体中化感活性较强的一类成分。香草酸(vanillic acid)是植物体中常见的酚酸类成分之一。很多学者从植物的茎、叶、根等器官［1－3］或含有植物残体的土壤［4－6］中分离出香草酸并对其进行了化感作用方面的研究，也有学者从植物种子中分离出香草酸并对其进行了种子萌发抑制作用方面的研究［7－10］，但有关香草酸抑制植物生长及种子萌发的作用机制方面的研究报道尚不多见［10］。

青钱柳〔Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinsk.〕又称摇钱树、麻柳，为胡桃科(Juglandaceae)青钱柳属(Cyclocarya Iljinsk.)植物，是中国特有的单种属植物，也是国家重点保护野生植物之一。青钱柳具有较高的药用、保健、材用和观赏等价值，是极具开发利用前景的珍贵树种。但由于青钱柳种子发育差并具有深休眠特性，因此天然更新困难，大量人工栽培也受到严重阻碍［11］。

前期研究结果表明:青钱柳种皮中含有的一些内源抑制物质可能是导致青钱柳种子休眠和幼苗生长受阻的原因之一［12］。采用系统溶剂法对抑制活性最强的青钱柳种皮甲醇提取液进行分离，其乙醚相的抑制活性最强，在乙醚相中香草酸的相对含量最高，达到35.09%，生物测定结果显示香草酸对不结球白菜(Brassica campestris subsp.chinensis Makino)种子幼根生长有较强的抑制作用［13］;香草酸对青钱柳离体胚萌发和胚根伸长生长都有较强的抑制作用，其对青钱柳种子萌发的半抑制浓度为 81.33 mg·L－1［14］。但香草酸对青钱柳种子萌发的抑制作用机制并不清楚，也未见相关的研究报道。

作者将青钱柳离体胚接种到添加半抑制浓度(81.33 mg·L－1)香草酸的培养基中进行培养，并定期取样，对青钱柳离体胚萌发过程中相关生理生化指标的变化以及各生理生化指标间的相关性进行了分析，以期更深入地了解香草酸对青钱柳离体胚萌发的抑制作用机制，为打破青钱柳种子休眠技术的研发提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

于2006年11月在云南昆明植物园内采集成熟的青钱柳种子，千粒质量为108.45 g，饱满率63%。种子去翅后采用体积分数40%乙醇进行分选，选取下沉种子并晾干，使其饱满率达到90%。种子晾干后用透气的塑料篮子盛装，保存于室内阴凉、避光处待用。实验于2006年12月进行。

1.2 方法

1.2.1 离体胚的处理及培养方法 首先采用过滤灭菌法对香草酸母液(质量浓度50 g·L－1，用体积分数95%乙醇配制)进行灭菌处理，向已灭菌并冷却至约50℃的空白培养基(仅含8 g·L－1琼脂，pH 5.95～pH 6.00)中添加一定体积的香草酸母液，配制成含81.33 mg·L－1(半抑制浓度，IC50)香草酸的培养基，对照则加入等体积的体积分数95%乙醇，逐管分装。

青钱柳种子用体积分数70%乙醇处理1 min后，用质量体积分数0.2%HgCl2浸泡20 min，无菌水冲洗5～6次，然后用无菌水浸泡96 h后再进行常规消毒;先用体积分数70%乙醇处理1 min，再用质量体积分数0.1%HgCl2浸泡6.5 h。从已消毒种子中剥取较完整的离体胚分别接种到香草酸处理组和对照组培养基上。每管接种1个离体胚，每处理200管，各重复3次，每处理共计600管。置于温度(25±2)℃、光照时间12 h·d－1、光照度1 500～2 000 lx的条件下分别培养0、3、6、9和12 d后取样测定各项生理生化指标。将离体胚从试管中取出后用蒸馏水洗净并吸干表面水分(培养0 d的离体胚直接从种子中剥取)，根据测定指标样品量的要求准确称量后分装并置于液氮内速冻1 min，然后置于－70℃低温冰箱保存、备用、待测。

1.2.2 生理生化指标的测定方法 测定指标分别为粗脂肪、可溶性糖、淀粉和蛋白质含量;异柠檬酸裂合酶(ICL)、过氧化物酶(POD)、酸性磷酸酶(AP)和碱性磷酸酶(ALP)活性;葡萄糖－6－磷酸脱氢酶(G－6－PDH)和6－磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6－PGDH)联合活性。采用索氏提取法［15］184－185测定粗脂肪含量(以质量分数计);将提取粗脂肪后的样品烘干，采用蒽酮比色法［16］195－197测定可溶性糖和淀粉含量;采用考马斯亮蓝 G－250 染色法［16］184－185测定蛋白质含量;参照宋松泉等［17］80－82和邢更妹等［18］的方法测定 ICL 活性;参照文献［19］的方法测定G－6－PDH和6－PGDH联合活性;采用愈创木酚法［16］164－165测定 POD 活性;参照宋松泉等［17］79－80的方法测定 AP 活性;参照文献［20］的方法测定ALP活性。

1.3 数据处理

采用SPSS 13.0统计分析软件对实验数据进行方差分析、差异显著性分析和相关性分析。将香草酸处理组和对照组所有同时段同一指标的测定数据合并后进行生理生化指标的相关性分析。

2 结果和分析

2.1 香草酸对青钱柳离体胚萌发过程中部分生理生化指标的影响

2.1.1 对贮藏物质含量的影响 在添加了半抑制浓度(81.33 mg·L－1)香草酸的培养基上，青钱柳离体胚萌发过程中粗脂肪、蛋白质、淀粉和可溶性糖4种主要贮藏物质含量的变化见表1。

表1 香草酸对青钱柳离体胚萌发过程中贮藏物质含量的影响1)Table 1 Effect of vanillic acid on content of storage substances in embryos in vitro of Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinsk.during germination process1)

由表1可见:随培养时间的延长，青钱柳离体胚的粗脂肪和蛋白质含量基本上呈不断下降的趋势，香草酸处理组的粗脂肪和蛋白质含量变幅比对照组小且在各培养时间都高于对照组。在培养前6天内，对照组及处理组的粗脂肪含量均小幅下降;培养第9天时对照组的粗脂肪含量迅速下降，至第12天粗脂肪含量仅为8.23%;而培养第9天处理组的粗脂肪含量仅略有降低，培养第12天处理组的粗脂肪含量虽然明显降低但仍高达21.62%，且培养第9天和第12天处理组离体胚的粗脂肪含量均显著高于对照组。培养第3天对照组离体胚的蛋白质含量比接种初期降低了27.9%，培养第9天时较初期降低了67.4%，培养第12天时则较第9天略有增加;而处理组的蛋白质含量则不断降低，且与同期对照组的蛋白质含量均有显著差异(P＜0.05)。

由表1还可见:随着培养时间的延长，香草酸处理组和对照组青钱柳离体胚的淀粉和可溶性糖含量均呈先降低后升高的变化趋势。在培养前6天内，处理组和对照组的淀粉含量均较初期略有降低但二者的差异基本不显著;而培养第9天和第12天处理组和对照组的淀粉含量均显著提高，至培养结束时二者的淀粉含量均达到最高，且处理组的淀粉含量显著低于对照组。在培养前6天内，处理组和对照组离体胚的可溶性糖含量急剧降低，均在第6天降至最低，其中第3天时处理组的可溶性糖含量显著高于对照组(P＜0.05);随后可溶性糖含量不断增加，至培养结束时二者的可溶性糖含量均达到最高，且处理组的可溶性糖含量显著高于对照组 (P＜0.05)。

差异显著性分析结果表明:培养12 d时，香草酸处理组和对照组青钱柳离体胚的粗脂肪和蛋白质含量均显著低于接种初期，而淀粉和可溶性糖含量则显著高于接种初期;在培养3～12 d内，香草酸处理组和对照组离体胚中前述4种贮藏物质的含量大多与接种初期有显著差异。

2.1.2 对一些酶活性的影响 在添加了半抑制浓度(81.33 mg·L－1)香草酸的培养基上，青钱柳离体胚萌发过程中一些酶活性的变化见表2和表3。

由表2可见:随着培养时间的延长，香草酸处理组和对照组离体胚的异柠檬酸裂合酶(ICL)活性均呈逐渐增强的趋势，但整体上看，同一时段对照组离体胚的ICL活性显著高于处理组(P＜0.05)。在培养第6天，对照组离体胚的ICL活性开始大幅度提高，且与处理组间的差异达显著水平，在培养第12天，对照组离体胚的ICL活性为培养初期的56.5倍;而处理组离体胚的ICL活性在培养第9天才大幅度提高，至培养第12天时其ICL活性仍小于对照组，并且也小于培养第6天对照组的ICL活性水平。

由表2还可见:在培养前6天，对照组青钱柳离体胚的葡萄糖－6－磷酸脱氢酶(G－6－PDH)和6－磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6－PGDH)联合活性变化不明显，在培养第9天时达到最高且与处理组间差异显著(P＜0.05)，在培养第12天有所降低。处理组离体胚的G－6－PDH和6－PGDH联合活性则从培养第6天开始一直上升，到第12天时达到最高，其活性水平与培养第9天时对照组的活性相近，这可能与处理组离体胚萌发受阻导致PPP途径活化推迟有关。

表2和表3的数据还表明:随着培养时间的延长，对照组和处理组青钱柳离体胚的过氧化物酶(POD)、酸性磷酸酶(AP)和碱性磷酸酶(ALP)活性均呈逐渐提高的趋势;在培养第12天，处理组青钱柳离体胚的POD活性显著高于对照(P＜0.05)，而其AP和ALP活性则显著低于对照。同一培养时段，对照组离体胚的AP和ALP活性大于处理组且增幅更大。在培养的第6天和第9天，处理组离体胚的ALP活性均显著低于对照组。

表2 香草酸对青钱柳离体胚萌发过程中一些酶活性的影响1)Table 2 Effect of vanillic acid on some enzyme activities of embryos in vitro of Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinsk.during germination process1)

表3 香草酸对青钱柳离体胚萌发过程中2种磷酸酶活性的影响1)Table 3 Effect of vanillic acid on two phosphatase activities of embryos in vitro of Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinsk.during germination process1)

差异显著性分析结果表明:在培养的第12天，香草酸处理组和对照组青钱柳离体胚的ICL、POD、AP和ALP活性以及香草酸处理组青钱柳离体胚的G－6－PDH和6－PGDH联合活性均显著高于接种初期(P＜0.05)。

2.2 青钱柳离体胚萌发过程中部分生理生化指标的相关性分析

青钱柳离体胚萌发过程中粗脂肪、蛋白质、淀粉和可溶性糖含量及ICL、POD、AP和ALP活性以及G－6－PDH和6－PGDH联合活性间的相关性分析结果见表4。

由表4可见:青钱柳离体胚萌发过程中粗脂肪含量和蛋白质含量与5个酶活性指标间均呈显著或极显著负相关，粗脂肪含量还与蛋白质含量和淀粉含量分别呈极显著正相关和显著负相关，蛋白质含量还与淀粉含量和可溶性糖含量呈极显著负相关;淀粉含量与可溶性糖含量、ICL活性、G－6－PDH和6－PGDH联合活性、POD活性和ALP活性均呈显著或极显著正相关;可溶性糖含量与ICL活性以及G－6－PDH和6－PGDH联合活性呈极显著正相关;ICL活性与G－6－PDH和6－PGDH联合活性、POD活性、AP活性及ALP活性均呈显著或极显著正相关;G－6－PDH和6－PGDH联合活性与POD活性呈极显著正相关;POD活性与AP活性及ALP活性均呈极显著正相关;AP活性与ALP活性也呈极显著正相关。

表4 青钱柳离体胚萌发过程中部分生理生化指标的相关性分析1)Table 4 Correlation analysis among some physiological-biochemical indexes of embryos in vitro of Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinsk.during germination process1)

3 讨论和结论

酚酸是一类重要的抑制植物种子萌发的成分，能够抑制自身和其他植物种子的萌发和生长，进而产生自毒效应和他感作用。相关研究表明:酚酸类成分主要通过阻碍气体交换、水分吸收、蛋白质合成［9］和酶活化［4－5］等生理活动对植物种子萌发产生抑制作用。

在种胚萌发过程中，随着细胞含水量的增加，各种受阻抑的代谢过程逐步恢复，细胞内部发生一系列生理生化变化，呼吸作用增强、各类贮藏物质被分解并转化为可利用的物质后运转到生长部位，作为幼胚生长的营养物质和能量来源。脂肪是青钱柳种子中最主要的贮藏物质，含量约50%［21］。本研究结果表明:受香草酸抑制作用的影响，在萌发过程中香草酸处理组青钱柳离体胚的粗脂肪含量均高于对照组，说明处理组的离体胚中脂肪降解较少，而对照组离体胚中的脂肪则能顺利降解。

Baleroni等［22］的研究结果显示:阿魏酸和香豆酸能降低脂肪代谢活性，阻止油菜(Brassica napus L.)种子萌发;Muscolo等［5］认为:脂肪是南欧黑松(Pinus laricio Poir.)种子中的主要贮藏物质，酚酸类物质可抑制脂肪代谢途径中异柠檬酸裂合酶(ICL)的活性从而影响种子的萌发。本研究也得到类似的实验结果。本研究结果表明:对照组和香草酸处理组的青钱柳离体胚中粗脂肪含量不断降低，与此相对应的是离体胚的ICL活性从培养第6天开始迅速提高，且对照组的ICL活性显著高于处理组，说明培养基中添加的香草酸抑制了青钱柳离体胚中ICL的活化从而使脂肪不能顺利降解，影响离体胚的萌发。

相关性分析结果表明:在青钱柳离体胚的萌发过程中，粗脂肪含量和蛋白质含量除与ICL活性有显著或极显著的负相关关系外，还与 G－6－PDH和6－PGDH联合活性以及POD活性、酸性磷酸酶活性和碱性磷酸酶活性有显著或极显著的负相关关系，说明青钱柳离体胚萌发过程中贮藏物质的转化与酶的活化紧密相关。

综上所述，在培养基中添加半抑制浓度(81.33 mg·L－1)香草酸能够抑制青钱柳离体胚萌发过程中各种酶的活化，导致主要贮藏物质的转化受阻，从而影响胚的萌发。

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