不同产地及株龄果用银杏叶中总银杏酸含量的比较

姚 鑫，周桂生，唐于平，钱大玮，宿树兰，段金廒

(南京中医药大学江苏省方剂高技术研究重点实验室，江苏南京210046)

银杏(Ginkgo biloba L.)是中国特有的集叶用、果用、材用、防护和观赏于一体的多功能树种。银杏叶和果实具有独特的药理效应，广泛应用于食品、保健品、化妆品和药品中，已逐渐成为全球植物药制剂与保健食品的前列品种。银杏叶为银杏的干燥叶，其提取物制剂在临床上用于治疗冠心病［1］、高血压［2］、脑梗死［3］、痴呆［4－5］、哮喘［6］、乙型肝炎［7］和糖尿病［8］等疾病。银杏叶主要含黄酮类和萜内酯类成分，还含有银杏酸类成分。银杏酸类成分具有致敏性、细胞毒性和免疫毒性等，是银杏叶提取物及其制剂中的主要毒性成分，因此，银杏酸的限量是评价银杏叶制剂质量的关键指标之一［9］。

叶用银杏主要为株龄4～7 a的植株，由于存在气温差异，7月份至9月份银杏叶中黄酮和萜内酯含量均较高，采叶较为适宜，可作为银杏提取物的原料［10－11］;银杏大多生长9～10 a后结果，但10月份采果后，大量的银杏叶因黄酮与萜内酯类成分含量偏低［12－13］而被废弃。笔者前期的研究结果表明:果用银杏的落叶中黄酮类与萜内酯类成分含量不高，且其组成变化不大［14］，如果通过富集利用也可能成为银杏叶提取物的原料，但其中银杏酸含量则未知。

笔者采用 HPLC 方法［9，15－16］，对不同产地及株龄果用银杏叶中银杏酸含量的变化进行比较分析，以期为果用银杏叶资源的深度开发利用提供实验数据。

1 材料和方法

1.1 材料

以2011年10月果实收获后的银杏叶为实验材料，分别采自位于山东郯城和泰安，江苏扬州、南京和泰兴，广西灵川，浙江安吉，安徽宁国，湖南永州，福建长汀，河北石家庄，贵州遵义和贵阳，辽宁丹东，河南洛阳以及四川成都和南台的银杏栽培区，每个产地收集1个样品(500 g);其中，在山东郯城分别选株龄10、15、20、25、30、50 和 100 a 的样株采集样叶，其余产地样株的株龄均为20 a。样品经南京中医药大学严辉博士鉴定为银杏的干燥叶，样本存放于南京中医药大学江苏省方剂高技术研究重点实验室。样品采集后于45℃烘干，粉碎后过40目筛，备用。

主要仪器:Waters 2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)、BT－125D型十万分之一电子分析天平(德国Satorius公司)、KH－2200B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)、Anke GL－16G－Ⅱ高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)和EPED－T纯水器(南京易普易达科技发展有限公司)。

供含量测定用的白果新酸对照品(批号:111690－200702)及供鉴别用的总银杏酸对照品(批号:111594－200603)均由中国药品生物制品鉴定所提供;甲醇为色谱纯(江苏汉邦科技有限公司)，水为自制超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液制备及标准曲线绘制 精密称取白果新酸对照品适量，加甲醇配制成质量浓度0.162 0 mg·mL－1的对照品溶液。另取总银杏酸对照品适量，作为鉴别用对照品溶液。

分别精密吸取白果新酸对照品溶液 1.0、2.0、4.0、8.0、16.0和32.0 μL，参照文献［9］的色谱条件进行 HPLC 测定。以对照品进样量(μg)为横坐标X、峰面积积分值为纵坐标Y进行线性回归分析，得到回归方程Y=5.24×105X－5.01×104(r=0.999 9)，显示白果新酸进样量在 0.162 ～5.184 μg 范围内呈良好的线性关系。

1.2.2 供试品溶液的制备及测定 取银杏叶粉末约1.0 g，精密称定后准确加入20 mL甲醇，闭塞并称取质量，用超声波辅助提取45 min(超声功率40 kHz)，冷却后再称取质量并用甲醇补足损失的质量，摇匀后用0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液即为供试品溶液。每个样品取3份，平行提取。按照标准曲线的色谱条件进行HPLC分析，每份样品测定3次，并采用外标法以白果新酸对照品计算总银杏酸含量。

1.2.3 方法学考察

1.2.3.1 精密度实验 精密吸取同一对照品溶液20 μL，按上述色谱条件重复进样测定6次，其峰面积的RSD为0.67%，表明仪器精密度良好。

1.2.3.2 重复性实验 取同一批银杏叶，制备6份供试品溶液，按上述色谱条件进样测定，白果新酸和总银杏酸含量分别为0.114%和1.03%，RSD 分别为1.75%和1.59%，表明本方法重复性较好。

1.2.3.3 稳定性实验 取重复性实验中的供试品溶液1份，分别于0、4、8、12和24 h按上述色谱条件进样测定，白果新酸和总银杏酸的RSD分别为0.87%和1.00%，表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。

1.2.3.4 回收率实验 取总银杏酸含量已知的样品6份，每份约0.5 g，精密称定后按照供试品溶液的制备方法处理并按上述色谱条件进样测定，平均回收率为99.7%，RSD为1.7%。

1.3 数据处理

采用SPSS 16.0统计分析软件对实验数据进行处理。

2 结果和分析

2.1 总银杏酸的HPLC分析结果

采用文献［9］的HPLC色谱条件及方法，果用银杏叶中5种主要银杏酸成分均得到较好的分离，对照品及样品的HPLC色谱图见图1。

2.2 不同株龄果用银杏叶总银杏酸含量的比较

来源于山东郯城的不同株龄果用银杏叶中总银杏酸含量的测定结果见表1。由表1可见:不同株龄果用银杏叶中总银杏酸含量有一定差异，其中，总银杏酸含量在株龄50 a的银杏叶中最高(质量分数1.20%)，在株龄25 a的银杏叶中最低(质量分数0.81%)。株龄10～30 a的银杏叶中总银杏酸含量均低于质量分数1%，而株龄50或100 a的银杏叶中总银杏酸含量均高于质量分数1%。一般认为，叶用银杏叶中总银杏酸含量为0.48% ～2.52%［9］，与此相比，来源于山东郯城不同株龄果用银杏叶中总银杏酸含量相对较低。

图1 银杏酸对照品及银杏叶样品HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of ginkgolic acid standard and Ginkgo biloba L.leaf sample

表1 不同株龄果用银杏叶中总银杏酸含量的测定结果Table 1 Determination result of total ginkgolic acids content in leaf of fruit-utilization type of Ginkgo biloba L.with different tree ages

2.3 不同产地果用银杏叶中总银杏酸含量的比较

来源于12个省区17个产地的果用银杏叶中总银杏酸含量的测定结果见表2。由表2可见:各产地果用银杏叶中总银杏酸含量差异较大。其中，福建长汀产果用银杏叶中总银杏酸含量最高(质量分数2.80%)，远超过文献［9］报道的叶用银杏叶中总银杏酸的含量(质量分数0.48% ～2.52%);江苏及其周边的山东、安徽、浙江等产地的果用银杏叶中总银杏酸含量均较低(质量分数0.51% ～0.99%)，显示出果用银杏叶中总银杏酸含量具有一定的区域性。

表2 来源于不同产地果用银杏叶中总银杏酸含量的测定结果Table 2 Determination result of total ginkgolic acids content in leaves of fruit-utilization type of Ginkgo biloba L.from different locations

3 讨论和结论

研究结果表明:果用银杏叶中银杏酸的含量因株龄和产地有较大差异。从株龄看，10～30 a生果用银杏叶总银杏酸含量偏低，50 a生果用银杏叶总银杏酸含量最高;按地区分布，来源于江苏及其周边山东、安徽和浙江等地的果用银杏叶中总银杏酸含量较低，而来源于福建长汀的果用银杏叶中总银杏酸含量最高。因此，在果用银杏叶利用过程中，除考虑其中银杏黄酮和萜内酯含量相对较高外，还应根据“总银杏酸含量较低”这一标准选择适宜的株龄和产地。

采用多层次成分富集技术，有望将果用银杏叶开发成为与银杏叶提取物相当的产品，并应用于医药与食品领域，为银杏的综合利用与开发提供新资源。

［1］张景云，路方红，吴坚美，等.银杏叶口服液对冠心病病人低密度脂蛋白氧化的抑制作用［J］.中国新药与临床杂志，1998，17(1):13－14.

［2］耿秀芳，孙晓丽，王洪刚，等.银杏叶总黄酮降压作用的实验与临床研究［J］.中国中药杂志，2002，27(8):606－608.

［3］朱日华，许尚臣，张秀清，等.银杏叶提取物治疗急性脑梗塞42例［J］.山东中医学院学报，1995，19(4):238－240.

［4］HAASE J，HALAMA P，HORR R.Effectiveness of brief infusions with Ginkgo biloba special extract EGB761 in dementia of the vascular and alzheimer type［J］.Zeitschrift für Gerontologie und Geriatrie，1996，29(4):302－306.

［5］KANOWSKI S，HERRMANN W M，STEPHAN K，et al.Proof of efficacy of the Ginkgo biloba special extract(GbE761)in outpatients suffering from mild to moderate primary degenerative dementia of the Alzheimer type or multi-infarct dementia［J］.Pharmacopsychiatry，1996，29(2):47－56.

［6］耿志广，郝凤亮，毛学忠.银杏叶片对缓解期哮喘患者气道高反应性及肺功能的影响［J］.临床荟萃，1999，14(4):151－152.

［7］王 京，主余华，任万华，等.银杏叶提取物治疗慢性乙型肝炎肝纤维化病人32例［J］.中国新药与临床杂志，2007，26(1):44－47.

［8］韩云丽，遆丹阳，滕东时.银杏叶提取物治疗2型糖尿病18例疗效分析［J］.哈尔滨医药，2005，25(4):29.

［9］鞠建明，黄一平，钱士辉，等.不同树龄银杏叶在不同季节中总银杏酸的动态变化规律［J］.中国中药杂志，2009，34(7):817－819.

［10］钱大玮，鞠建明，朱玲英，等.不同树龄银杏叶在不同季节中总黄酮和总内酯的含量变化［J］.中草药，2002，33(11):1025－1027.

［11］孙兴力，周金彩，龙红萍，等.不同生长季节银杏叶中总黄酮醇苷和总内酯的含量变化［J］.中南药学，2009，7(8):564－567.

［12］崔北米，潘巧娜，龙凌云，等.银杏叶黄酮积累变化规律的初步研究［J］.湖南农业科学，2008(5):134－136.

［13］仲 英，唐文照，丁杏苞，等.不同树龄的银杏叶在不同生长季节中银杏总黄酮和总内酯的含量变化［J］.中草药，1999，30(12):909－910.

［14］姚 鑫，周桂生，唐于平，等.银杏落叶化学成分研究［J］.天然产物研究与开发，2012，24(10):1377－1381.

［15］吴向阳，仰榴青，陈 钧.不同生长季节银杏中有毒成分银杏酸含量的测定［J］.食品科学，2002，23(12):94－97.

［16］聂黎行，鲁 静.银杏叶提取物中总银杏酸的HPLC法限量检查［J］.药物分析杂志，2005，25(8):909－911.