Rb与C-erbB-2基因在胃癌前病变组织中的表达及其临床病理意义

苏秀丽，金建军

近年研究表明，胃癌的发生是一个多阶段渐进发展的癌变过程，是多因素相继或协同作用引起抑癌基因失活及癌基因的活化共同参与的结果，癌变之前经历持续多年的癌前病变。胃黏膜异型增生及肠型化生是目前明确的胃癌前病变，大量研究在胃癌前病变组织中检测到多种基因的异常表达。本研究检测抑癌基因Rb及癌基因C-erbB-2在胃癌前病变组织中的表达，探讨二者的表达在胃癌变过程中的意义。

1 材料和方法

1.1材料①标本：87例慢性胃炎胃黏膜活检组织，取自河南科技大学第一附属医院胃镜室，病理诊断为胃黏膜慢性炎症伴轻度异型增生29例、中度异型增生36例、重度异型增生22例，其中异型增生伴肠化35例,异型增生分级参照全国内镜协作组的异型增生组织分级标准[1]。②试剂：鼠抗人Rb基因蛋白免疫组化单克隆抗体、鼠抗人C-erbB-2免疫组化单克隆抗体、即用型快捷免疫组化MaxVisionTM试剂盒、DAB显色试剂盒、PBS缓冲液、柠檬酸抗原修复液、EDTA 抗原修复液购自福州迈新生物技术产品开发公司。

1.2方法所取标本常规10%中性缓冲福尔马林溶液固定，石蜡包埋，取切片经伊红染色做病理诊断，依照免疫组化说明书，采用免疫组化一步法检测Rb基因、C-erbB-2基因的表达。判定标准，C-erbB-2 蛋白免疫组化染色参照美国 Hercept Test 评价标准[2]：每张切片选取连续的10 个高倍视野(×400)，每个视野计数100个细胞，算出各个视野中阳性细胞数，无阳性细胞或阳性细胞<10%及仅胞质着色者为阴性(-)，阳性细胞>10%定为阳性(+)。显色弱且不连续为(+)；阳性细胞>10%，呈连续胞膜显色，强度中等为(++)；阳性细胞>10%，胞膜显色呈连续强阳性者为(+++)。 Rb蛋白免疫组化染色参照Mark Kelley实验室标准[3]进行，每张切片随机选取10个高倍视野，计数100个细胞中的阳性数,根据阳性细胞百分率及显色深浅,采用半定量积分法分级。评分标准如下：①显色深浅:按着色程度分为:基本未着色0分，着浅色(黄色)为1分，中度着色(棕黄)为2分，强阳性着色(棕褐)为3分。②按阳性细胞百分率分为:染色细胞数≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～75%为2分，>75%为3分。以上两项相加最终评定结果，0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，3～4分为中度阳性(++)，5～6分为强阳性(+++)。

1.3统计学处理采用SPSS 17.0统计软件对实验所得的数据进行统计分析，分类资料用χ2检验，相关分析用Spearman相关系数进行相关分析，P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1基因Rb、C-erbB-2在胃癌前病变组织中的表达Rb阳性着色为棕褐色，定位于细胞核，为胞核内出现棕褐色颗粒，少数同时有细胞浆着色。试验结果表明，从轻度异型增生、中度异型增生到重度异型增生，基因Rb阳性表达率分别为86.21%、75%、54.55%，趋势卡方分析P<0.05，呈下降趋势，轻度异型增生与重度异型增生相比表达明显降低，差别有统计学意义(P<0.05)，提示 Rb阳性表达随病变加重而降低。C-erbB-2蛋白阳性着色为棕黄色，定位于包膜，少数有胞浆着色，仅胞浆着色为非特异性着色；随病变加重，基因C-erbB-2在轻度异型增生、中度异型增生及重度异型增生中表达的阳性率为20.69%、33.3%、50%，呈上升趋势(P<0.05)，和轻度异型增生相比，重度异型增生阳性表达明显增加(P<0.05)，提示基因C-erbB-2阳性表达随病变加重而升高。实验结果见表1。

表1 基因Rb、C-erbB-2在胃癌前病变中的阳性表达 例(%)

2.2基因Rb和C-erbB-2表达的相关性统计结果示Spearman相关系数r=-0.129，P>0.05，二者表达无相关性，见表2。

表2 基因基因Rb和C-erbB-2在胃癌前病变中表达的相关性

3 讨论

细胞周期调控异常是导致细胞增殖、凋亡失衡以及肿瘤发生的分子生物学基础。Rb 基因是细胞周期的负性调控因子，是最早发现的抑癌基因，位于细胞周期G1/S调控点的中心。低磷酸化的Rb蛋白与转录因子E-2F结合成复合物，使E-2F失去转录激活功能，细胞周期便停留在G1期，完成遗传物质的节点检测，并通过抑制多种原癌基因如c-myc、c-fos等而抑制细胞增殖，减少肿瘤的发生。所有人类肿瘤均存在Rb基因表达异常，一半为基因突变[4]，一半为调控异常，失去对转录因子E-2F及原癌基因c-myc、c-fos的抑制，不能完成染色体的节点检测，使损伤的遗传物质表达于新的子代细胞，并出现细胞分裂增殖活跃，参与了肿瘤的发生[5]。本研究结果表明，Rb在胃癌前病变中的表达率为73.56%(轻、中、重度异型增生分别为86.21%、75%、54.55%)，随病变加重，呈降低趋势，与文献[6]报道一致。结果提示，检测基因Rb的表达可用于监测胃癌前病变的进展。

原癌基因C-erbB-2是细胞基因组的正常成分，其表达产物具有酪氨酸蛋白激酶活性，在细胞增殖及分化调控中起重要作用，正常情况下处于非激活状态。该基因在多种致病因素作用下，可因点突变、获得启动子、增强子、基因扩增与重排等被活化,表现为基因的扩增和产物的高表达, 具有致癌变活性。张朝军等人[7]研究提示：C-erbB-2 基因的表达不仅发生于重度异型典型增生及胃癌组织中，而且在轻、中度异型增生及肠上皮化生组织中也出现 C-erbB-2 基因的表达。研究发现，在胃癌前病变中，C-erbB-2表达明显增加[8-10]，本研究结果表明，胃黏膜中、重度异型增生C-erbB-2表达(33.33%、50.00%)明显增加，与文献报道一致，提示C-erbB-2广泛活化参与了胃癌癌变过程。

现代肿瘤学认为，肿瘤的发生必须有至少两个肿瘤相关基因的异常激活或失活，并且同时有原癌基因的活化和抑癌基因的失活。本研究检测到在胃癌前病变组织中抑癌基因Rb和原癌基因C-erbB-2的异常表达，统计分析表明，二者无明显相关性，提示二者同时或相继出现异常表达增加了胃癌前病变癌变的风险，需要密切随访。以上研究结果提示，检测基因Rb、C-erbB-2可用于监测胃癌前病变的进展，以指导胃癌前病变的临床干预。

参考文献：

[1] 中华医学会消化病学分会.中国慢性胃炎共识意见(2006年,上海) [J].中华消化内镜杂志,2007, 24(1): 58-63.

[2] Cell Markers and Cytogenetics College of American Pathologists.Clinicollaboratory assays for HER-2/neu amplification and overexpression:quality assurance,standardization and proficiency testing[J].Arch Pathol Lab Med,2002,126(7):803-808.

[3] Dong W,Meihua L,Kelly M. Human apurinic endonucleasa 1(APE1)expression and prognostic significance in osteosarcoma to DNA damaging agents using silencing RNA APE1 expression inhibition[J].Mol Cancer Ther,2004,3(6):679-686.

[4] Yamasaki L.Role of RB tumor suppressor in cancer[J].Cancer Treat Res,2003,115(9):209-239.

[5] Camboa-Dominguez A,Seidl S,Reyes-Gutierrez E,et al.Prognostic significance p21WF1/CIP1,p27Kipl,p53 and E-cadherin expression in gastric cancer[J].Clin.Pathol,2007,60(7):756-761.

[6] 缪林,赵志泉,季国忠,等.胃癌前病变及胃癌组织中抑癌基因P16、Rb及周期素D1蛋白表达的研究[J].南京医科大学报,2003,23(3):272-274.

[7] 张朝军,葛海燕, 靳文生,等.胃黏膜癌变过程中细胞增殖及C-erbB-2 与 EGFR 表达的研究[J].肿瘤防治杂志, 2004,11(2):123-126.

[8] Meert AP,Martin B,Paesmans M,et al.The role of HER-2/neu expression on the survival of patients with lung cancer:a systematic review of the literature[J].Brit J Cancer,2003,89(6):959-965.

[9] Werner M,Becker KF,Keller G,et al.Gastric adenocarcinoma: pathomorphology and molecular pathology [J].Cancer Res Clin Oncol,2001,127(4): 207-216.

[10] Wang LJ,Chen SJ,Chen Z,et al.Morphological and pathologic changes of experimental chronic gastritis (CAG) and the regulating mechanism of protein expression in rats[J].J Zhejiang Univer,2006,7(8): 634-640.