尼可地尔后处理对心肌缺血－再灌注损伤大鼠心肌的保护作用

李悦玮，张文琪，孙景辉，张科强

（1.吉林大学第一医院儿内五科，吉林 长春130021；2.吉林大学中日联谊医院心内科，吉林 长春130033；3.吉林大学第二医院医务部，吉林 长春130041）

尼可地尔后处理对心肌缺血－再灌注损伤大鼠心肌的保护作用

李悦玮1，张文琪2，孙景辉1，张科强3

（1.吉林大学第一医院儿内五科，吉林 长春130021；2.吉林大学中日联谊医院心内科，吉林 长春130033；3.吉林大学第二医院医务部，吉林 长春130041）

目的：观察尼可地尔后处理对心肌缺血－再灌注损伤 （MIRI）大鼠心肌的保护作用，并探讨其作用机制。方法：26只SD大鼠随机分为对照组 （8只）、盐酸异丙肾上腺素 （ISO）组 （8只）和尼可地尔后处理组（10只）。对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水，ISO组大鼠腹腔注射ISO 5mg·kg－1，每隔24h重复注射1次，连续注射3d；尼可地尔后处理组于注射ISO 1h后尾静脉注射尼可地尔 （1mg·kg－1），每日1次，连续3d。于第3次注射ISO后24h断尾取血后处死，检测各组大鼠血清中乳酸脱氢酶 （LDH）、磷酸激酸 （CK）活性；常规HE染色观察各组大鼠心肌组织形态学表现；免疫组织化学染色法检测Caspase－3蛋白的表达；TUNEL法检测各组大鼠心肌细胞凋亡情况。结果：尼可地尔后处理组与对照组比较血清LDH和CK活性差异无统计学意义 （P＞0.05），但2组均低于ISO组 （P＜0.05）。HE染色，ISO组大鼠局部心肌组织变性坏死，伴有炎细胞浸润；尼可地尔后处理组大鼠坏死心肌细胞明显减少，炎症反应轻微；对照组大鼠心肌无异常表现。免疫组织化学染色，ISO组大鼠大量心肌细胞胞浆表达Caspase－3，对照组和尼可地尔后处理组大鼠Caspase－3无表达。尼可地尔后处理组细胞凋亡指数 （AI）较ISO组明显降低 （P＜0.01）。结论：尼可地尔可减轻大鼠MIRI，其作用机制可能与抑制Caspase－3激活、减少细胞凋亡有关。

心肌缺血－再灌注损伤；尼可地尔；缺血后处理；药物后处理；细胞凋亡

缺血性心脏病一直是引起患者心力衰竭和死亡的主要原因［1］。冠心病无论在发达国家还是发展中国家，已经成为严重危害人类健康和致死的主要疾病之一［2］。尽管近年来血运重建技术 （溶栓、经皮冠状动脉腔内成形术和冠状动脉旁路移植术）已经取得了很大进展，但在缺血性心脏病再灌注治疗中，如何保护缺血心肌免于心肌缺血－再灌注损伤（myocardial ischemia－reperfusion injury， MIRI）一直是研究热点。缺血后处理 （ischemic postconditioning，IPO）和药物后处理因适于临床操作成为研究热点。已有研究［3－4］表明：尼可地尔在临床上作为治疗心绞痛的药物，对缺血－再灌注心肌有保护作用。但目前关于尼可地尔心肌MIRI的保护作用机制的研究较少。本研究利用大鼠心肌缺血模型，在分子和细胞水平上观察尼可地尔药物后处理对缺血－再灌注大鼠心肌的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物、主要试剂及仪器 SD大鼠26只，雄性，体质量180～200g，由吉林大学基础医学院实验动物中心饲养 （许可证号：SCXK－吉2008－0005）；尼可地尔购自Sigma公司，盐酸异丙肾上腺素 （ISO）购自上海禾丰制药厂，乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒、磷酸激酸 （CK）试剂盒购自南京建成生物工程研究所，Caspase－3购自美国Cell Signaling公司，TUNEL法检测试剂盒购自Roche公司；GF－D 200型半自动生化分析仪为山东高密彩虹分析仪器公司产品。

1.2 实验分组及模型制备 将26只SD大鼠随机分为3组：对照组8只，盐酸异丙肾上腺素（ISO）组8只，尼可地尔后处理组10只。对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水；ISO组大鼠给予腹腔注射ISO 5mg·kg－1，每隔24h重复注射1次，连续注射3d。尼可地尔后处理组大鼠于注射ISO 1h后尾静脉注射 （1mg·kg－1），每日1次，连续3d。ISO组和尼可地尔后处理组于第3次注射ISO后24h处死，同时处死对照组大鼠。

1.3 大鼠血清样本的制备 分别于处死大鼠前穿刺尾静脉或断尾获取外周血1mL，3 000r·min－1离心5min，取上清，再于高速低温离心机13 000r·min－1离心15min，取上清，－20℃冻存备用。LDH 和CK活性检测按试剂盒说明书操作。

1.4 大鼠心脏病理组织学检测标本的制备 第3次注射后24h处死各组大鼠，消毒后取出大鼠心脏，放入PBS中冲洗，10%甲醛溶液固定；常规石蜡包埋，4μm连续切片，行HE和免疫组织化学染色 （SP法）。TUNEL法具体步骤按照试剂盒说明书操作。标记前用DNA酶处理切片作为阳性对照，用标记液代替TUNEL反应液作为阴性对照。在400倍光镜下观察心肌细胞凋亡情况，随机选取10个视野，以心肌细胞凋亡数占总心肌细胞数的百分比计算心肌细胞凋亡指数 （AI）。

1.5 AI结果判定标准 Caspase－3以心肌细胞胞浆出现棕黄色颗粒，其着色强度高于背景染色者判定为阳性，否则为阴性。TUNEL法以胞核出现棕黄色颗粒为阳性，否则为阴性。结果判定由2名观察者独立完成，若判定结果不一致，则2人在共览显微镜下共同观察判定。

1.6 统计学分析 采用SPSS 11.0软件处理数据。各组大鼠血清CK和LDH活性以±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清CK和LDH活性 LDH检测，ISO组大鼠血清LDH活性高于对照组 （P＜0.05），尼可地尔后处理组血清LDH活性明显低于ISO组 （P＜0.05）；CK检测，ISO组大鼠血清CK活性高于对照组 （P＜0.05），尼可地尔后处理组明显低于ISO组 （P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清CK和LDH活性Tab.1 The activities of serum CK and LDH of rats in various groups （±s）

表1 各组大鼠血清CK和LDH活性Tab.1 The activities of serum CK and LDH of rats in various groups （±s）

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with ISO group.

Group n CK［λB／（mU·L－1）］LDH［λB／（U·L－1）］Control 8 44.71±3.83 4 297.70±599.95 ISO 8 61.26±7.69＊ 6 992.37±828.58＊Nicorandil postconditioning 10 47.12±5.09△ 4 700.23±812.67△

2.2 各组大鼠心肌组织形态学表现 HE染色，ISO组大鼠心内膜内皮不完整，在心肌细胞间可见小血管扩张及少量红细胞渗出，部分心肌细胞肿胀、变性坏死，心肌组织内血管扩张、炎细胞渗出、浸润和其包绕血管形成的血管周围炎；尼可地尔后处理组大鼠心肌横纹清晰，核居中，无明显组织坏死、血管扩张和炎细胞浸润轻微。见图1（插页四）。

2.3 各组大鼠心肌细胞凋亡情况 TUNEL法检测，ISO组大鼠可见大量的凋亡细胞，凋亡阳性的细胞核呈棕黄色。尼可地尔后处理组大鼠凋亡细胞明显减少。对照组、ISO组、尼可地尔后处理组大鼠的AI分别为 （0.66±0.35）%、（22.38±3.65）%和 （7.57±1.84）%。尼可地尔后处理组的 AI明显低于ISO组 （P＜0.01）。见图2 （插页四）。

2.4 各组大鼠心肌组织中Caspase－3的表达 对照组和尼可地尔后处理组大鼠心肌细胞中无阳性物质；ISO组注射ISO后3d大鼠心肌细胞胞浆可见大量棕黄色颗粒。见图3（插页四）。

3 讨 论

2003年，Zhao等［5］首先提出IPO的概念，即于缺血后持续再灌注前给予多次短暂重复缺血－再灌注，能提高心肌对缺血－再灌注损伤的耐受性。为缺血性心脏病的治疗开辟了新途径。通常情况下，心肌细胞线粒体钾通道处于关闭状态，但能被钾离子开放剂激活，参与保护缺血后的心肌［6］。钾离子通道开放剂通过促进线粒体基质中钾的摄入，形成稳定的钾离子流，从而抑制钙超载［7］。钙超载可引起线粒体通透性转换孔开放 ，许多大分子非选择性地由胞浆向线粒体扩散，导致线粒体电位破坏和功能障碍，使能量代谢发生障碍，引起心肌细胞死亡。在缺血预处理的研究［8－10］中，钾离子通道开放剂尼可地尔能够保护缺血性损伤的心肌。尼可地尔通过开放心肌细胞线粒体钾离子通道，保护线粒体，减轻MIRI，减少心肌细胞坏死或凋亡，从而保护心肌。本研究以保护线粒体为切入点，旨在为临床心肌缺血缺氧的对症治疗提供新思路。

本实验利用ISO腹腔注射制作心肌缺血性损伤模型，并观察尼可地尔后处理对缺血心肌的保护作用。大剂量ISO导致心脏β1受体过度兴奋，心率加快，心肌收缩力增加，心肌耗氧增加；β2受体兴奋，扩张外周血管，降低外周血管阻力，血压降低，特别是舒张压降低，减少冠状动脉供血，结果使心肌缺血缺氧［10－12］。血清酶学变化是心肌损害程度的主要标志，本研究结果显示：连续大剂量给予ISO后大鼠血清CK、LDH活性增高，表明该方法能够完全模拟心肌损伤的病理生理过程，复制心肌损伤的模型。尼可地尔后处理能够减轻ISO对心肌的缺血性损伤。心肌病理学检查是心肌缺血损害程度的直接证据。大剂量ISO注射后，HE染色显示：心肌细胞发生变性坏死，伴有大量炎细胞浸润；免疫组织化学染色见大量心肌细胞表达Caspase－3；TUNEL染色见大量心肌细胞凋亡。尼可地尔后处理组大鼠HE染色示心肌细胞无明显变性、坏死，炎细胞浸润轻微；Caspase－3免疫组织化学染色显示：少量大鼠心肌细胞表达Caspase－3；并见少量凋亡的心肌细胞。这些结果说明心肌缺血影响线粒体功能，导致细胞能量代谢障碍，激活Caspase－3细胞凋亡途径，引起心肌细胞发生不可逆性损伤甚至坏死。

［1］Lloyd－Jones D，Adams RJ，Brown TM，et al.Heart disease and stroke statistics－－2010update： A report from the American Heart Association ［J］. Circulation，2010，121 （7）：948－954.

［2］况志彬，何春蓉，周 艳，等.早发冠心病血运重建后临床危险因素及其与预后的相关性分析 ［J］.重庆医科大学学报，2012，39 （7）：817－820.

［3］Hsu CY，Fang SY， Chen YZ，et al. Cardiovascular protection of activating KATP channel during ischemiareperfusion acidosis ［J］.Shock，2012，37 （6）：653－658.

［4］Horinaka S.Use of nicorandil in cardiovascular disease and its optimization ［J］.Drugs，2011，71 （9）：1105－1119.

［5］Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion：comparison with ischemic preconditioning ［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，285 （2）：H579.

［6］Garlid KD， Paucek P， Yarov－Yarovoy V， et al.Cardioprotective effect of diazoxide and its interaction with mitochondrial ATP－sensitive K＋channels. Possible mechanism of cardioprotection ［J］.Circ Res，1997，81 （6）：1072－1082.

［7］Wu LP，Shen F，Lin L，et al.The neuroprotection conferred by activating the mitochondrial ATP－sensitive K＋channel is mediated by inhibiting the mitochondrial permeability transition pore ［J］.Neurosci Lett，2006，402 （1／2）：184－189.

［8］Ahmed LA，Salem HA，Attia AS，et al.Pharmacological preconditioning with nicorandil and pioglitazone attenuates myocardial ischemia／reperfusion injury in rats ［J］.Eur J Pharmacol，2011，663（1－3）：51－58.

［9］Raveaud S，Verdetti J，Faury G.Nicorandil protects ATP－sensitive potassium channels against oxidation－induced dysfunction in cardiomyocytes of aging rats ［J］.Biogerontology，2009，10 （5）：537－547.

［10］Rona G.Catecholamine cardiotoxicity ［J］.J Mol Cell Cardiol，1985，17 （4）：291－300.

［11］Iliodromitis EK，Aggeli IK，Gaitanaki C，et al.Catherine Gaitanakip38－MAPK is involved in restoration of the lost protection of preconditioningby nicorandil in vivo ［J］.Eur J Pharmacol，2008，579（1－3）：289－297.

［12］付双全.人参的心血管作用药理学研究进展 ［J］.长春中医药大学学报，2012，28（2）：357－358.

Protective effect of nicorandil postconditioning on myocardium of rats with myocardial ischemia－reperfusion injury

LI Yue－wei1，ZHANG Wen－qi2，SUN Jing－hui1，ZHANG Ke－qiang3
（1.Department of Pediatrics，First Hospital，Jilin University，Changchun 130021，China；2.Department of Cardiology，China－Japan Union Hospital，Jilin University，Changchun 130033，China；3.Department of Medical Adminisitration，Second Hospital，Jilin University，Changchun 130041，China）

ObjectiveTo explore the protective effect of nicorandil postconditioning on myocardium of rats with myocardial ischemia－reperfusion injury （MIRI）in rats and to discuss its mechanism.Methods26SD rats were divided into control group （n＝8），isoproterenol（ISO）group （n＝8）and nicorandil postconditioning group （n＝10）.The rats in ISO group were injected intraperitoneally with isoproterenol（5mg·kg－1）at an interval of 24h for 3d；the rats in control group only

an injection of same amount of saline；the rats in nicorandil postconditioning group were injected intravenously with nicorandil（1mg·kg－1）1hafter ISO injection once a day，lasting for 3d.The rats were killed 24hafter the third injection of ISO.The activities of serum creatine kinase（CK）and lactate dehydrogenase（LDH）of rats in various groups were detected；the histopathological changes of myocardium of rats in various groups were observed by routine HE staining；the expressions of Caspase－3protein were determined by immunohistochemistry；the apoptosis of cardiocytes of rats in various groups was analyzed by TUNEL staining.ResultsThere were no significant differences in the activites of serum CK and LDH between nicorandil postconditioning group and control group （P＞0.05），but the activities of CK and LDH in control and nicorandil postconditioning groups were lower than those in ISO group（P＜0.05）.The HE staining results showed local degeneration，necrosis and inflammation in ISO group，but slightly necrosis and inflammation in nicorandil postconditioning group and no pathological changes in control group.Immunohistochemistry staining showed that Caspase－3was positive in cardiocyte plasma in ISO group；however，there were no Caspase－3expression in control and nicorandil postconditioning groups.The apoptosis index （AI）in nicorandil postconditioning group was significantly decreased compared with ISO group （P＜0.01）.ConclusionNicorandil can attenuate MIRI of rats，and its mechanism may be related to inhibiting Caspase－3pathway and decreasing the cardiocyte apoptosis.

myocardial ischemia－reperfusion injury；nicorandil；postconditioning；pharmacological conditioning；apoptosis

R542.2

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1160－04

2012－06－13

吉林省卫生厅科研基金资助课题 （2009z004）

李悦玮 （1975－），女，吉林省长春市人，讲师，在读医学博士，主要从事心血管疾病的基础和临床研究。

张科强 （Tel：0431－88796754，E－mail：zhangkeqiang＠yahoo.com.cn）