siRNA－Gli－1联合BCNU抑制胶质瘤细胞U251增殖

田海龙，李惠武，李 卉，段明军，姜孝芳，白靖平*

(新疆医科大学1.附属肿瘤医院;2.基础医学院细胞与分子生物教研室;3.第一附属医院医学中心，新疆乌鲁木齐830000)

神经胶质瘤的发病率占原发颅内肿瘤第1位。临床针对胶质瘤进行手术辅助放化疗的综合治疗，但治疗效果并不理想。近年来发现Hedgehog(Hh)信号通路的异常激活在胶质瘤的发生发展中起重要作用。该通路通常通过核转录因子Gli-1(glioma-associated oncogene homolog 1，Gli-1)发挥作用。Gli-1成为Hh信号最终的响应者和功能的执行者，其核酸水平的表达是Hh通路早期活化的标志，是整个通路最主要的环节［1－2］，Gli-1的异常高表达可能促进胶质瘤发生和发展。

卡莫司汀(carmustine，BCNU)是治疗脑肿瘤常用的药物之一，但静脉注射该药对骨髓、肝脏和肺脏的不良反应大，限制药物的临床应用［3］。为探索更理想的胶质瘤治疗方法，本研究观察siRNA联合BCNU影响胶质瘤细胞凋亡和增殖的作用效果，探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人胶质瘤U251细胞(中国科学院上海细胞生物学研究所);RPMI1640和胎牛血清(Gibco公司);反转录试剂盒及Trizol(Invitrogen公司);AnnexinⅤ凋亡试剂(上海晶美公司);siRNA和脂质体LipofectamineTM2000(上海吉玛公司);兔抗人 Gli-1、BCL-2、cycinD1和BAX多克隆抗体(武汉博士德公司);Western blot试剂盒及碘化丙啶(Propidiumiodide，PI)(Sigma公司);BCNU注射液(上海伊明公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞系培养:含1×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素和10%灭活胎牛血清的RPMI1640作为培养基，复苏U251胶质瘤细胞，5%CO2、37℃培养，2～3 d传代1次。取对数生长期的细胞用于实验。

1.2.2 siRNA-Gli-1合成、转染及浓度筛选:根据人Gli-1序列(Genbank，NM_00116 0045)中转录RNA的作用位置及小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)设计原则，确定人Gli-1的siRNA目标寡核苷酸序列，由上海吉玛公司设计并合成针对Gli-1的siRNA干扰片段(Gli-1-siRNA)和阴性对照siRNA(negative control siRNA，NC)，绿色荧光素酶(FAM)标记(FAM-siRNA)。设siRNA-Gli-1不同浓度梯度10、50、100 nmol/L各3个复孔，重复6次，收集转染6 h后的U251细胞，倒置荧光显微镜观察，流式细胞仪检测转染效率，筛选siRNA-Gli-1最佳浓度。

1.2.3 转染后细胞形态学的观察:将对数生长期的U251细胞随机分为3组:siRNA-Gli-1组(筛选后的siRNA-Gli-1干扰片段);空转组(Lipofectamine，lipo group);空白组 (RPMI1640 group)作为对照，250μL PRMI1640稀释的 siRNA-Gli-1，同 Lipofectamine混匀，室温下保温孵育20 min，转染细胞，光镜观察。

1.2.4 反转录聚合酶链反应(半定量PCR)检测转染及 BCNU处理后 Gli-1、cyclin D1、BCL-2和 BAX mRNA水平的表达:随机分组如下:BCNU组(BCNU注射液，预实验确定浓度为1.5 mg/L)、siRNA-Gli-1组、联合组(combination group，siRNA-Gli-1+1.5 mg/L BCNU)、空转组和空白组。所有引物(表1)均由上海生工公司合成。PCR产物用1×TBE电泳缓冲液的2%(W/V)琼脂糖凝胶(含0.5 mg/L的溴乙锭)电泳，紫外线投射反射仪下观察结果，凝胶图像分析仪扫描。

1.2.5 Western blot检测转染及BCNU处理后Gli-1、cyclin D1、BCL-2及BAX蛋白的表达水平:分组同1.2.4，细胞转染48 h后提取总蛋白，经Bradford法测定蛋白浓度，蛋白质等量样品与2×SDS凝胶加样缓冲液混合，煮沸变性5 min;上样蛋白为60μg，每组分别取20μg用以检测内参GAPDH蛋白质，取60μg用以检测Gli-1蛋白质，经12%SDS-PAGE电泳，30 V 4℃电转移过夜转至硝酸纤维素 (NC)膜;丽春红S染色10 min以观察各电泳带蛋白质量是否一致;4℃封闭过夜;洗膜30 min，加入用TBS稀释的一抗 (1∶50)，GAPDH(1∶400)4℃孵育8 h;洗膜30 min，羊抗兔IgG抗体 (1∶6 000)室温共孵育4 h，洗膜30 min;加入ECM试剂，曝光，显影，定影，X线胶片拍照保存。

1.2.6 流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测细胞凋亡及细胞周期:分组同1.2.4，消化细胞，并及时加入含血清的完全培养基终止反应。轻微吹打使细胞脱壁，500 r/min离心5 min收集细胞，弃上清，洗涤2次。悬浮细胞得单细胞悬液，加入纯乙醇，终浓度达70%以固定细胞，置4℃过夜。离心弃乙醇，再洗涤细胞2次;加碘化丙啶染色液30μL，15 min。流式细胞仪测定细胞凋亡百分比及周期。

1.2.7 甲基噻唑基四唑法(methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT法)检测细胞增殖 分组同1.2.4。取对数生长期细胞，制成单细胞悬液，调整浓度至105/mL，按2×104/孔接种于96孔培养板中，终体积200 μL/孔，设6 个复孔，分别于转染后12、24、48 和72 h加人20μL MTT(5 g/L)/孔，继续培养4 h弃上清，加二甲基亚砜150μL，室温静置20 min，振荡10 min至紫色结晶完全溶解，酶标仪490 nm波长处测各孔吸光度值。实验重复6次，绘制细胞增殖曲线。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞形态学改变与筛选结果

当lipofectamine∶siRNA干扰片段 =50 pmol∶5μL转染后，倒置荧光显微镜观察，从2 h开始，细胞发出绿色荧光，6 h视野满布荧光细胞(图1A)。经FCM检测，siRNA-Gli-1和NC转染的效率约为69.20% ～73.80%，因此后续实验均按此比例进行。光镜下观察，空白组和空转组的U251细胞均贴壁生长，梭形或多角形，有突起;细胞均匀分布，胞膜有良好的折光性;siRNA-Gli-1组的细胞在24 h出现死亡，48 h死亡细胞明显增加(图1B)。

表1 各待测因子引物序列、扩增长度及扩增条件Table 1 The primer sequences，the length and condition of amplification of each factors

2.2 U251细胞中 Gli1、cyclin D1、BCL-2及 BAX的mRNA和蛋白水平表达

各组中Gli-1蛋白同mRNA表达水平基本一致(图2)。各组中BCL-2、BAX及cyclin D1蛋白表达具有差异(图3)。

图3 Western blot检测各组Gli-1、BCL-2、BAX和Cyclin D1蛋白的表达Fig 3 Detection of protein expressio of Gli-1，BCL-2，BAX and Cyclin D1 in different groups

2.3 siRNA-Gli-1联合BCNU对U251细胞凋亡的影响

处理48 h后，siRNA-Gli-1组、BCNU组、联合组与空转组和空白组之间有显著差异(p＜0.01);siRNA-Gli-1组与BCNU组和联合组之间有显著差异(p＜0.05)BCNU组与联合组之间有显著差异(p＜0.05)(图4)。

2.4 细胞周期分析结果

空白组和空转组细胞的G1期百分比含量明显低于其他3个实验组;细胞的S期百分比含量与此相反(p＜0.01)(表2)。

图4 转染和BCNU处理48 h后各组细胞凋亡检测Fig 4 Detection of cells apotosis in each group 48 hours after transfection and being treated by BCNU

表2 各组在不同细胞周期时段的细胞含量Table 2 The cell contents in different phases in different group

2.5 U251细胞增殖抑制率检测结果

MTT法显示12 h开始，空白对照组、空转组A值逐步升高、24 h后升高明显;siRNA-Gli-1组、BCNU组和联合组48 h后缓慢升高。与空白及空转组对比，siRNA-Gli-1 组、BCNU 组和联合组 12、24、48、72 h细胞生长抑制率均随时间的延长而显著升高，24～72 h内，联合组细胞生长受抑制最明显(p＜0.05)(图4)。

图5 各组细胞增殖检测结果Fig 5 Detection of cells proliferation in each group on different times by MTT

3 讨论

Gli-1异常激活，调控下游靶基因的异常转录，对胶质瘤的发生和恶性生物学特性的维持极为重要［4－5］。RNA 干扰(RNA interference，RNAi)是目前干扰基因表达研究的热点，其核心是由21～25 nt双链RNA介导的序列特异性转录后的基因静默过程［6］。本研究将siRNA-Gli-1转染于人胶质瘤U251细胞，沉默Gli-1表达，抑制细胞增殖，细胞凋亡增加。在此基础之上，联合化疗药物BCNU，观察对U251细胞增殖及相关因子表达的影响。BCNU不抑制Gli-1的表达，但是BCNU和siRNA-Gli-1都使得BCL-2表达降低，BAX表达上调，BCL-2/BAX比例下降。二者联合，这一作用增强(p＜0.05)。研究证实，BCNU作为细胞周期非特异性烷化剂，具有诱导细胞凋亡的作用，作用机制是通过影响caspase 3通路改变BCL-2和BAX的表达［3］。本研究发现，Gli-1转录受到RNAi干扰后，BCL-2/BAX比例改变，造成肿瘤细胞凋亡逃逸机制失调，对BCNU的敏感性增加，促使凋亡率增高［7－8］。流式细胞检测结果显示，siRNA-Gli-1组、BCNU组、联合组增加U251细胞凋亡比例，联合组促进凋亡的效果更为明显(p＜0.05);同BCL-2/BAX表达的变化一致;细胞增殖的程度受Gli-1表达的影响，靶向Gli-1的siRNA-Gli-1，具有抑制胶质瘤U251细胞增殖和促进凋亡的作用。Gli-1调控BCL-2的表达，影响U251细胞增殖和凋亡;细胞增殖曲线显示，siRNAGli-1和BCNU联合显著增加单用BCNU或siRNAGli-1对U251细胞的抑制程度(p＜0.05)，其抗肿瘤作用可能通过增强肿瘤细胞的促凋亡和抑制抗凋亡基因的表达双重机制来实现的。

作为调节G0/G1期的细胞周期相关蛋白，cyclin D1在胶质瘤中过表达，与肿瘤增殖和侵袭密切相关［9］。过表达cyclin D1使G1期缩短，对分裂原的依赖性减弱，并异常启动S期相关基因的转录，加速细胞分裂或转化［9－10］。siRNA-Gli-1 通过干扰Gli-1的转录导致cyclin D1表达下调，抑制细胞进入S期从而延缓细胞增殖。没有发现BCNU促进siRNA-Gli-1下调cyclin D1表达的证据，但是siRNA-Gli-1和BCNU联合对细胞周期抑制效果增强。是Hh和caspase-3信号通路表达共同增强的结果，还是有其他通路的参与?具体机制不清楚，需进一步探讨。

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