基于谱效相关的生地黄多指标成分定量分析方法的研究

王 梅 郭东艳 师延琼 王 幸

生地黄具有清热凉血、养阴生津之功效，主要用于治疗血热出血证，现代临床用以治疗原发性血小板减少性紫癜、功能性子宫出血等疾病［1，2］。为控制生地黄药材的质量，笔者采用高效液相色谱法建立了生地黄止血作用的指纹图谱，以梓醇为对照品，对达到基线分离的色谱峰进行定量，计算出各指纹峰相对于梓醇的含量，并以其总量控制药材的质量。

材料与方法

1．材料与仪器:Waters2695高效液相色谱仪，Empower色谱工作站，2996二级管阵列检测器;SB3200DT超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份公司);梅特勒电子天平(万分之一);KZW－G型仪表恒温不锈钢水浴锅(上海)。UV－1102型可见—紫外分光光度仪(上海天美科学仪器有限公司)。甲醇、乙腈均为色谱纯，水为纯净水，其他试剂均为分析纯。梓醇对照品(中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号110808－200407)。生地黄购自西安盛兴中药饮片有限责任公司(批号分别为 20100810、20101018、20101209)，经陕西中医学院生药教研室王继涛老师鉴定为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch．的干燥块根。

2．方法:(1)止血作用指纹图谱的建立:色谱柱:Akasil－C18 柱(250．0mm ×4．6mm，5μm)，流动相:乙腈(A)－ 水(B)梯度洗脱，0～5minA 由0．3%升至 1．0%，5 ～10min 1．0%升至2．6%，10 ～16min 2．6%，16 ～32minA 由2．6%升至 8．0%，32～40minA由8%升至15%，40～65minA由15%升至30%;检测波长为210nm;柱温:30℃;流速:1ml/min。指纹图谱见图1［3］。(2)指纹峰的标定:根据图1，对达到基线分离的色谱峰进行标定，确定为含量测定的对象。(3)对照品溶液的制备:取梓醇对照品适量，精密称定，加流动相溶解成每1ml含0．13mg的溶液，即得。(4)供试品溶液的制备:精密称取生地黄粉末约1g，加入流动相20ml超声提取，滤过，取滤液蒸干，残渣用流动相定容于5ml量瓶中，以微孔滤膜(0．45μm)滤过，即得。(5)标准曲线的绘制:分别精密吸取梓醇对照品溶液(浓度为 0．13mg/ml)1、5、10、15、20μl，按上述色谱条件注入色谱仪，以峰面积A为纵坐标，梓醇含量C(μg)为横坐标绘制标准曲线，回归方程为 A=270000．0000C+14585．0000，相关系数 r=0．9999，梓醇在 0．13 ～2．60μg呈良好的线性关系。(6)精密度试验:精密吸取对照品溶液10μl，按上述色谱条件重复进样6次，记录峰面积，结果RSD为3．08%，表明本方法精密度良好。(7)重复性试验:取同一批号(20100810)样品，共5份，按“供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取10μl进样，在上述色谱条件下，样品中梓醇的平均含量为2．5236mg/g，RSD为2．25%，表明此方法重复性良好。(8)稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液(批号20100810)10μl，分别于0、2、4、8、12h 进样。结果 12h 内梓醇峰面积的RSD(n=5)为1．26%，表明供试品12h内稳定。(9)加样回收率试验:取已知含量的生地黄(批号20100810)约0．5g，精密称定，分别精密加入一定量的梓醇对照品，按“供试品溶液的制备”项下方法及色谱条件进行试验，结果梓醇的平均回收率为98．47%，RSD为0．67%(n=5)。

结 果

1．生地黄止血作用多指标含量测定方法的建立:经过方法学考察，确定生地黄止血作用多指标含量测定的色谱条件为:色谱柱:Akasil－C18柱(250mm×4．6mm，5μm)，流动相:乙腈(A)－ 水(B)梯度洗脱，0～5minA 由0．3%升至 1．0%，5 ～10min 1．0%升至2．6%，10 ～16min 2．6%，16 ～32minA 由 2．6% 升至8．0%，32～40minA由8%升至15%，40～65minA由15%升至30%;检测波长为210nm;柱温:30℃;流速:1ml/min。梓醇在0．13 ～2．60μg呈良好的线性关系(r=0．9999)，平均回收率为 98．4%，RSD 为 0．67%。表明所建方法简便，测定结果可靠。HPLC色谱图见图1。

图1 生地黄止血作用的HPLC指纹图谱

2．样品含量测定:取本品3批样品，按“供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，依上述色谱条件测定，采用外标一点法计算样品中各指纹峰相对于梓醇的含量，结果见表1。

表1 样品中各指纹峰相对于梓醇的含量测定(n=3)

讨 论

中药指纹图谱是指应用色谱及其联用技术最大限度地获取有用的化学信息，结合化学计量学的理论与方法，进行数据解析和特征信息的提取，合理优化、量化指纹图谱，建立多模式多柱色谱、多元检测、多水平评价的系统方法。其对控制中药及其制剂的质量控制起到了一定的积极作用。但是中药指纹图谱在质量控制方面仍存在一定的局限性。如果能将中药的指纹图谱与药效结合进行研究，这样既能确保中药产品的有效、安全和稳定可控;同时又与中药自身的特色相契合，是当前在中药质控方面进行研究的科技工作者所面临的共同问题。目前正逐步发展起来的“谱”与“效”的相关研究在未来有可能成为解决这一难题的“钥匙”［4］。基于以上原因，笔者在对生地黄止血作用物质基础筛选的基础上，建立了生地黄止血作用的指纹图谱［3，5］。为了对指纹图谱进行定量分析，选择了以梓醇为基准峰，其他峰的面积与梓醇峰面积进行比较，得到各指纹峰的相对含量，这样一方面可以有效控制制剂的质量，同时又解决了其他对照品难以获得，致使含量无法测定的问题。

1 国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)［S］．北京:化学工业出版社，2010:115－116

2 谢琦敏，叶忠伟．张仲景运用地黄功用探讨［J］．浙江中医药大学学报，2009，33(6):742 －743

3 郭东艳，张丽娟，王梅，等．生地黄止血有效部位HPLC指纹图谱研究［J］．中国实验方剂学杂志，2011，17(4):90 －92

4 陈洪渊．中药谱效相关研究的思路与方法［J］．中国天然药物，2010，8(3):161

5 王梅，张丽娟，郭东艳，等．生地黄止血作用药效物质基础的初步研究［J］．时珍国医国药，2011，22(6):1938 －1939