左卡尼汀对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌肥厚的保护作用及机制研究

姚秀云，杨育红，宋 莹，王洪新，张 晶，李洪秀

(1.辽宁医学院药理学教研室，辽宁 锦州 121000;2.辽宁省盘锦市第二医院，辽宁 盘 锦 124000)

心肌肥厚(myocardial hypertrophy，MH)是心血管疾病患者发病率和死亡率增加的一个重要原因，心肌肥厚最终发展成心衰。左卡尼汀(L-carnitine)又称左旋肉碱，是哺乳动物能量代谢必需的体内天然物质，对细胞中能量的产生和转运起重要作用。L-carnitine能促进脂肪酸经β-氧化进人三羧酸循环，产生能量，与机体的器官、组织代谢密切相关［1］。L-carnitine的缺乏会导致能量供应障碍及脂肪酸代谢的各种中间产物累积酸中毒，出现心肌病变、心律失常、机体疲劳等症状［2］。一般认为在缺血、缺氧时，心肌细胞内脂肪酸β-氧化障碍，脂肪酸堆积，葡萄糖酵解增强，腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)水平下降，线粒体膜结构改变，线粒体膜相崩解而导致细胞死亡。另有研究表明L-carnitine通过线粒体外膜上的卡尼丁脂酰转移酶I和内膜内侧的卡尼丁脂酰转移酶Ⅱ作用，促使脂肪酸进一步分解。L-carnitine能调节乙酰辅酶A/脂酰辅酶A的比值，从而激活丙酮酸脱氢酶复合体的活性，促进葡萄糖的代谢［3］。临床应用L-carnitine辅助治疗冠心病、心绞痛、心肌梗死合并心源性休克均具有一定疗效，但是应用L-carnitine在心肌肥厚及能量代谢方面的研究尚未见报道。因此本实验采用异丙肾上腺素(Isoproterenol，Iso)诱导的大鼠心肌肥厚模型，观察L-carnitine对心肌肥厚及反映线粒体功能的线粒体膜电位的影响，初步探讨L-carnitine改善心肌肥厚后在能量代谢方面的相关机制。

1 材料与方法

1.1 药物、主要仪器与试剂 L-carnitine:沈阳东宇精细化工厂，批号:101101，纯度98%。乳酸LAC测定试剂盒、游离脂肪酸FFA测定试剂盒、总蛋白测定试剂盒(考马斯亮蓝法)、羟脯氨酸测定试剂盒:南京建成生物工程研究所。线粒体膜电位Jc-1试剂盒:江苏碧云天生物技术研究所。激光扫描共聚焦显微镜(Leica sp5，德国Leica)

1.2 实验动物、模型制备及分组 清洁级，SD大鼠，♀♂各半40只，体质量180～200 g，由辽宁医学院实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK(辽)2003-0007。

大鼠随机分为4组，每组♀♂各5只。① Iso组:按Rona等［4］方法略作修改，皮下注射(sc)Iso，以20、10 和 5 mg·kg－1·d－1剂量递减 3 d，再以 3 mg·kg－1·d－1连续 7 d，每天腹腔注射蒸馏水 2 ml·kg－1;②空白组:以等量生理盐水代替Iso处理，并以等量蒸馏水腹腔注射;③ L-carnitine组:sc Iso同时给予 L-carnitine，按 100 mg·kg－1剂量腹腔注射每天1次;④ Propranolol组:sc Iso同时给Propranolol，按50 mg·kg－1剂量腹腔注射每天1次。各组均持续8周，标准饮食饮水。术后正常饮食，定期观察生长状态。

1.3 测定心肌肥厚的指数 麻醉开胸，取心脏，称全心湿重(heart wet weight，HW)及左心室湿重(left ventricle wet weight，LVW)，计算心脏质量指数(heart mass index，HMI=HW/BW，mg·kg－1)和左室质量指数(left ventricular mass index，LVMI=LWH/BW，mg·g－1)。

1.4 测定心脏血流动力学指标 4组大鼠于停药24 h后称体重(body weight，BW)，腹腔注射20%乌拉坦(5 ml·kg－1·d－1)麻醉。于颈部偏右侧开纵行切口，分离右颈总动脉，经右颈总动脉插入聚乙烯导管，用Pclab生物信号采集处理系统，导管插入3～3.5 cm即可进入左心室，稳定5 min后测定大鼠心室收缩压(left ventricular systolic pressure，LVSP)、心室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)及左室压力变化最大速率(±dp/dtmax)。

1.5 Masson染色检查心肌组织改变 取心尖组织迅速固定于10%甲醛中，常规石蜡包埋，制备石蜡切片，石蜡横断面连续切片5～6片，厚度约5 μm。切片常规脱蜡脱水，行Masson染色，光镜下做常规观察。

1.6 测定心肌生化指标 取心尖组织100 mg，置入含0.9%生理盐水0.9 ml的试管中，用匀浆器匀浆，得到组织匀浆。按试剂盒方法考马斯亮蓝法测定心肌总蛋白，测定心肌羟脯氨酸(hydroxyproline，Hpy)游离脂肪酸(free fatty acids，FFA)、乳酸(lactic acid，LAC)含量。

1.7 心肌细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)的测定 按照文献［5－6］的方法制备肥厚心肌的单个心室肌细胞，取(1～6)×105细胞，重悬于 0.5 ml KB 液(mmol·L－1:L-谷氨酸70，牛磺酸 20，KCl 40，EGTA 0.5，KH2PO420，MgCl23，D-glucose 10，HEPES 10，KOH 70)中保存。加入JC-1染色工作液，细胞培养箱中37℃孵育20 min。用JC-1染色缓冲液洗涤2次，再用适量JC-1染色缓冲液重悬。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光;在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光。激光共聚焦显微镜检测JC-1单体时把激发光设置为490 nm，发射光设置为530 nm得到红色荧光图像;检测JC-1聚合物时，把激发光设置为525 nm，发射光设置为590 nm观察得到绿色荧光图像，此两通道重叠得到橘色图像，并测得荧光强度。随机选择20个视野，每个视野约测4个细胞。通过对红色和绿色荧光强度的比值计算出MMP的相对数值。

2 结果

2.1 L-carnitine对心肌肥厚大鼠心脏指数的影响

Iso连续注射10 d可引起大鼠HMI和LVMI两指数增加50.2%和63.1%;L-carnitine和普萘洛尔能降低注射Iso后大鼠的HMI和LVMI，P＜0.01，而与空白组比较，差异无显著性(见Fig 1)。

Fig 1 Effect of L-carnitine on heart mass index(HMI)and left ventricular mass index(LVMI)in myocardial hypertrophy induced by Isoproterenol(Iso)in rats(±s，n=8)

2.2 L-carnitine对心肌肥厚大鼠血流动力学的影响 Iso连续注射10 d可引起大鼠－dp/dtmax和LVEDP高于空白组36%和50%，+dp/dtmax和LVSP也有所增加;L-carnitine和Propranolol能改善注射Iso后大鼠工作心脏的－dp/dtmax和LVEDP，分别降低了33.8%和21.4%(P＜0.01)(Tab 1)。

2.3 L-carnitine处理后心肌组织病理学观察 大体观察见Iso组大鼠心脏体积较空白组明显增大，L-carnitine组和propranolol组大鼠心脏增大不明显。光镜下，空白组(A)心肌细胞未见明显肥大及坏死，无胶原纤维增生;Iso组(B)见心肌细胞变大，有灶性坏死，大量胶原纤维增生呈大斑片状，病理改变多位于心尖部心内膜下层;L-carnitine组(C)和prop-ranolol组(D)可见心肌细胞肥大程度较Iso组减轻，心肌纤维排列整齐，偶有点片状坏死，胶原纤维增生较少(Fig 2)。

Tab 1 Effects of L-carnitine on hemodynamic parameters in myocardial hypertrophy induced by Isoproterenol(Iso)in rats(±s，n=8)

Tab 1 Effects of L-carnitine on hemodynamic parameters in myocardial hypertrophy induced by Isoproterenol(Iso)in rats(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs Iso group

Group LVSP/kPa LVEDP/kPa+dp/dtmax/kPa·s－1－dp/dtmax/kPa·s －1 Control 13.9 ±1.1 5.5 ±0.9 1056 ±46 985 ±70 Iso 16.3±1.5＊＊ 8.4±1.3＊＊ 751±61＊＊ 628±57＊＊L-carnitine 15.2 ±0.9# 6.6 ±0.5## 862 ±75# 840 ±69##Propranolol14.9 ±0.9## 6.5 ±0.5## 891 ±81## 866 ±90##

Fig 2 Effect of L-carnitine on myocardial tissue pathogenic changes of myocardial hypertrophy induced by Isoproterenol(Iso)in rats

2.4 L-carnitine对大鼠左心室肌组织LD和FFA含量和Hpy的影响 Iso组HPY、LAC和FFA含量高于空白组53.7%、23.1%和30.2%，L-carnitine和Propranolol能降低注射Iso后大鼠的这3项指标，各自降低了15.8%、14.5%和16.9%，但 L-carnitine组在Hpy上与空白组还是有差异，propranolol组在FFA上与空白组有差异。表明L-carnitine可以降低心肌的Hpy含量，防止胶原沉积;降低心肌FFA和LAC含量，防止其在细胞中的堆积(Tab 2)。

2.5 L-carnitine对心肌细胞线粒体膜电位影响通过对红色和绿色荧光强度的比值计算出线粒体膜电位的相对数值。与空白组比较，Iso组MMP降低了37.3%，差异具有统计学意义(P＜0.01)。L-carnitine和propranolol组与Iso组相比MMP增高，差异有显著性。表明L-carnitine可以在一定程度上起到保护心肌线粒体的作用(Fig 3，4)。

Tab 2 Effects of L-carnitine on contents of hydroxyproline(Hpy)，lactic acid(LAC)and free fatty acids(FFA)in myocardial hypertrophy induced by Isoproterenol(Iso)in rats(±s，n=8)

Tab 2 Effects of L-carnitine on contents of hydroxyproline(Hpy)，lactic acid(LAC)and free fatty acids(FFA)in myocardial hypertrophy induced by Isoproterenol(Iso)in rats(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs Iso group

Group Hpy/μg·g－1Pro LAC/mmol·g－1Pro FFA/μmol·g－1Pro Control 0.41 ±0.039 0.39 ±0.036 195.87 ±24.71 Iso 0.63 ±0.028＊＊ 0.48 ±0.084＊＊ 254.26 ±25.11＊＊L-carnitine 0.53 ±0.031## 0.41 ±0.035## 211.53 ±22.65##Propranolol 0.48 ±0.021＊＊ 0.46 ±0.015＊＊ 244.16 ±40.90＊＊

3 讨论

目前，MH已被公认为是猝死、心力衰竭等心血管事件强有力的独立危险因素，因此，探索用于防治该病的药物对与临床用药有重要的指导意义。Iso是一种人工合成的儿茶酚胺，连续皮下注射Iso可以起MH，操作简单易于掌握，这一模型已被广泛使用［7］。本次试验在此模型基础上用L-carnitine干预治疗，普萘洛尔为对照，目的在于观察L-carnitine对Iso所致大鼠MH的保护作用。结果显示:L-carnitine有改善心功能、降低重量指数、抗心肌细胞肥大的作用。Iso组在心脏重量指数、羟脯氨酸含量指标中都较空白组有明显增加，说明连续注射Iso确实可引起大鼠MH并伴有纤维化，对心肌组织切片的镜下观察也可以充分证实这一点。而MH伴纤维化也正是该组大鼠心脏舒张功能下降的直接原因。L-carnitine能改善Iso所引起的心脏重量指数增加和Hpy含量的增高，外部表现即为心功能的恢复。

有人认为L-carnitine心肌保护作用的可能机制是减少心肌对 ATP储备的消耗，拮抗脂质过氧化［8］，从而在能量代谢、细胞保护、血管新生等多环节发挥作用。临床观察应用L-carnitine辅助治疗患者冠心病、心绞痛、心肌梗死合并心源性休克的疗效观察，均发现L-carnitine组心功能明显改善，治疗组疗效明显优于对照组［9］。L-carnitine在大鼠缺血/再灌注中具有抗心律失常的作用且该作用可被肉碱脂酰转移酶I(CPTI)抑制剂依托莫司(etomoxir)拮抗。提示我们L-carnitine的作用可能与促进线粒体对脂肪酸的氧化有关［10］。本次试验的结果就 L-carnitine对Iso引起MH大鼠心肌组织中的FFA和LAC增多都有很好的调节作用，使FFA和LAC减少。这些变化心肌肥厚的能量代谢机制直接相关，同时也不能排除其对线粒体保护所产生的作用。线粒体膜电位(MMP)是反映线粒体功能的重要生物能量学参数［11－12］，控制线粒体呼吸率、ATP和ROS`生成，其电位值大小可以直接反映线粒体功能的变化。Iso组的线粒体膜电位明显降低，L-carnitine明显提高线粒体膜电位，对线粒体的具有保护作用，又在心肌肥厚能量代谢的另一方面起到了调节作用。

Fig 3 Effects of L-carnitine on mitochondrial membrane potential(MMP)of hypertrophic cardiomyocytes induced by Iso in rats

综上所述，L-carnitine可以通过对肥厚心肌细胞能量代谢的调节，起到改善Iso致大鼠心肌肥厚的作用，为临床防治心肌肥厚提供新的思路。然而L-carnitine是如何作用达到保护线粒体的，其具体机制有待进一步实验探讨。

Fig 4 Quantitative results of JC-1 fluorescence as a marker for membrane potential changes(±s，n=5)

［1］Tang J M，Xie Q Y，Pan G D，et al.Mesenchymal stemcells participatein angiogenesis and improveheart function in ratmodel of myocardial ischemiawith reperfusion［J］.Eur J Cardiothorac Surg，2006，30(2):353－61.

［2］时慧琦，殷仁富，张治宇，等.左卡尼汀对高血压并发糖尿病大鼠心肌代谢和心功能的影响［J］.心脏杂志，2009，21(2):165－9.

［2］Shi H Q，Yin R F，Zhang Z Y，et al.Influence of L-carnitine on myocardial metabolism and function in rats suffering from hypertension complicated by diabetes［J］.China Heart J，2009，21(2):165－9.

［3］黄 洁，严文华.左卡尼汀对大鼠阿霉素心肌病的干预作用［J］.苏州大学学报(医学版)，2009，29(2):259－61.

［3］Huang J，Yan W H.Effect of L-carnitine on adriamycin-induced dilated cardiomyopathy in rats［J］.Suzhou Univ J Med Sci，2009，29(2):259－61.

［4］Rona G，Chappel C I，Balazs T，et al.An infact-like myocardial lesion and other toxic manifestations produced by isoproterenol in the rat［J］.Arch Pathol Lab Med，1959，67:443.

［5］Katoh H，Nishigaki N，Hayashi H.Diazoxide opens the mitochondrial permeabilitytransition pore and alters Ca2+transients in rat ventricular myocytes［J］.Circulation，2002，105(22):2666－71.

［6］Saotome M，Katoh H，Satoh H，et al.Mitochondrial membrane potential modulates regulation of mitochondrial Ca2+in rat ventricular myocytes［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，288(4):H1820－8.

［7］Kitagawa Y，Yamashita D，Ito H，Takaki M.Reversible effects of isoproterenol-induced hypertrophy on in situ left ventricular function in rat hearts［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004，287(1):H277－85.

［8］向到康，孙宗全，夏家红，等.左－卡尼汀心停搏液对犬体外循环心肌的保护作用［J］.中国药理学通报，2007，23(7):945－8.

［8］Xiang D K，Sun Z Q，Xia J H，et al.Myocardial protective effect of L-carnitine cardioplegia solution in canine undergoing cardiopulmonary bypass［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(7):945－8.

［9］陈冬梅，沈 涛，李玉洁，等.左卡尼汀治疗老年冠心病心衰的疗效观察［J］.中国现代医药杂志，2010，12(1):51－7.

［9］Chen D M，Shen T，Li Y J.Effect of L-carnitine on heart failure in the elderly patients with coronary heart disease［J］.Mod Med J China，2010，12(1):51－7.

［10］Najafi M，Garjani A，Maleki N.Antiarrhythmic and arrhythmogenic effects of L-carnitine in ischemia and reperfusion［J］.Bull Exp Biol Med，2008，146(2):210－3.

［11］Liedtke A J.The origins of myocardial substrate utilization from an evolutionary perspective:The enduring role of glucose in energy metabolism［J］.J Mole Cell Cardiol，1997，29:1073－86.

［12］Marcil M，Ascah A，Matas J，et al.Compensated volume overload increases the vulnerability of heart mitochondria without affecting their functions in the absence of stress［J］.J Mol Cell Cardiol，2006，41(6):998－1009.