土槿乙酸抑制人卵巢癌SKOV3细胞增殖并诱导G2/M期阻滞

2012-12-06徐忠伟陈小义徐瑞成

中国药理学通报 2012年4期

买霞，徐忠伟，陈小义，徐瑞成

(1.中国人民武装警察部队后勤学院基础部细胞生物学与医学遗传学教研室;2.天津市职业和环境危害生物标志物重点实验室，天津 300162)

土槿乙酸(pseudolaric acid-B，PLAB)是从我国松科植物金钱松的根皮及近根皮中分离出来的二萜类化合物，药理作用广泛。近来研究表明［1－3］，PLAB可以抑制胃癌MGC-803、乳腺癌MCF-7和前列腺癌PC-3等多种肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡，其抗肿瘤作用多与细胞G2/M期阻滞相关。研究发现［2］，PLAB作用于MCF-7细胞时，细胞阻滞于G2/M期，细胞周期蛋白Cyclin B1和CDK1呈高表达状态。本实验观察PLAB对人卵巢癌SKOV3细胞周期的影响及其与细胞周期相关蛋白之间的关系，为阐明PLAB抗癌作用机制积累资料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂人卵巢癌细胞株SKOV3购自中科院上海生命科学研究院细胞库，土槿乙酸由天津武警后勤学院生药教研室提供，无水乙醇溶解成母液，浓度为 1 mmol·L－1，－20℃避光保存，使用时用细胞培养液稀释至终浓度，培养液中无水乙醇终浓度低于0.1%。H-DMEM培养基为Gibco公司产品。胎牛血清由中国医学科学院血研所提供。TRIzol试剂由Invitrogen公司生产;四甲基偶氮唑盐(MTT)、Hoechst 33342、碘化丙啶(PI)和二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司产品;PrimeScriptTMRT逆转录试剂为大连TaKaRa公司产品;一抗兔抗人Cyclin B1、CDK1和Cyclin D1多克隆抗体均购Abcam公司，二抗购自KPL公司，ECL化学发光试剂购自Millipore公司。

1.2 细胞增殖抑制检测(MTT法) 调整细胞密度为4×104·L－1，接种于96孔板，每孔加细胞悬液100 μl，培养24 h待细胞贴壁后作药物处理，实验组PLAB(终浓度分别为 10、5、1、0.5、0.1 μmol·L－1)，同时设对照组(不加药)和空白组(只加培养基)，每组设6个复孔，分别继续培养24、48和72 h，加 MTT 20 μl，4 h 后加入 DMSO 200 μl，避光振荡10 min，全自动酶标仪570 nm处测定各孔吸光度(A值)。

1.3 Hoechst 33342荧光染色检测细胞死亡特征5 μmol·L－1PLAB 作用细胞 12 和 24 h 后收集细胞，Hoechst 33342荧光染色，荧光显微镜下观察细胞形态，照相记录。

1.4 流式细胞术检测细胞周期［4］0.5、1和5 μmol·L－1PLAB作用细胞12和24 h后，分别收集细胞，PBS洗2次，体积分数为0.75冷乙醇固定，上机前弃乙醇，PBS洗1次，加入 RNase 100 mg·L－1，和5 g·L－1碘化乙啶(PI)染色剂，避光染色20 min，流式细胞仪检测细胞周期分布。

1.5 RNA提取和Real time-PCR检测Cyclin B1和CDK1 mRNA表达 5 μmol·L－1PLAB作用细胞12和24 h后，收集细胞，TRIzol法提取细胞总RNA，按 PrimeScriptTMRT试剂盒操作合成 cDNA。引物序列见Tab 1，Real time-PCR反应体系为20 μl(上游引物 1 μl，下游引物 1 μl，cDNA 2 μl，SYBR green PCR master mix 4 μl，ddH2O 12 μl)。扩增条件95℃变性10 min:94℃变性5 s，65℃退火 15 s，72℃延伸15 s，共45个循环:荧光检测分析扩增曲线和溶解曲线，反应冷却至40℃。实验独立重复3次。根据Roche 1.5检测系统提供Cp(Crossing Point)值，△Cp=CpGene－CpGAPDH，△△Cp=△Cptreated－ △Cpcontrol，通过相对定量法(2－△△Ct)，计算各基因mRNA表达。

1.6 Western blot法检测 Cyclin B1、CDK1 和 Cyclin D1蛋白表达 5 μmol·L－1PLAB作用细胞12和24 h后，收集细胞，预冷PBS溶液洗细胞2次，每孔加入100 μl细胞裂解液［含 50 mmol·L－1Tris-HCl(pH 8.3)、150 mmol·L－1NaCl、0.02% 十二烷基硫酸钠、1%NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%原矾酸钠、100 μmol·L－1苯甲基磺酰氟溶液］，用细胞刮将细胞刮下，冰上裂解30 min，4℃低温离心(15 min，12 000 r·min－1)，吸取上清。样品采用 BCA法蛋白定量，上样60 μg蛋白，进行SDS-PAGE，转移至聚氟乙烯(PVDF)膜上。5%脱脂奶粉封闭2 h后，加入1∶1 000稀释的兔抗人Cyclin B1、CDK1和Cyclin D1多克隆抗体，4℃孵育过夜，TBST洗膜后，加入1∶3 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗室温孵育2 h，TBST洗涤，经ECL液化学发光，暗室X线片曝光，显影定影。用BandScan 5.0软件进行A值分析。

Tab 1 Sequences of PCR primers

Tab 2 Inhibitory effect of PLAB in SKOV3cell proliferation of each group at different time points(A，±s，n=6)

The PLAB groups were different significantly compared with control group，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

PLAB final concentration/μmol·L －1 Time/h 24 48 72 0 1.3202 ±0.0859 2.6002 ±0.1623 2.2777 ±0.1094 100.5675 ±0.0211＊＊ 0.7218 ±0.0403＊＊ 0.5218 ±0.0301＊＊5 0.6113 ±0.0489＊＊ 0.7697 ±0.0273＊＊ 0.6190 ±0.0111＊＊1 0.7693 ±0.0286＊＊ 1.1752 ±0.1009＊＊ 1.0252 ±0.0782＊＊0.5 1.0248 ±0.0854* 2.2157 ±0.0528* 2.2615 ±0.0835 0.1 1.241 ±0.0729* 2.3080 ±0.1173*2.311 ±0.0856

2 结果

2.1 土槿乙酸对SKOV3细胞增殖抑制作用 SKOV3细胞经 PLAB(终浓度为 10、5、1、0.5、0.1 μmol·L－1)处理后，均受到不同程度的抑制，并呈时间及剂量依赖性，其中药物作用24、48和72 h的IC50值分别为 2.44、1.60、2.94 μmol·L－1(Tab 2)。

2.2 土槿乙酸可诱发SKOV3细胞凋亡经荧光染色后可见对照组细胞形态规整，核较大，核染色质均匀，被Hoechst 33342染成蓝色均匀一致荧光(Fig 1A)。5 μmol·L－1PLAB 处理的 SKOV3细胞可见规律性的变化，即作用12、24 h后部分细胞呈现形态不规则，核染色质凝集，核膜破裂等凋亡细胞形态(Fig 1B，1C)。

2.3 SKOV3细胞周期变化 PLAB(终浓度分别为0.5、1、5 μmol·L－1)作用于 SKOV3细胞 12 和 24 h后流式细胞术分析细胞周期结果显示(Fig 2)，对照组G2/M期细胞比例分别为12.5%和15%;0.5、1、5 μmol·L－1PLAB 作用于 SKOV3细胞 12 h，G2/M期细胞比例分别为18.4%、40.3%、52.4%;作用24 h G2/M期细胞比例分别为29.3%、42.5%、53.9%，差异具有统计学意义(P＜0.05)。由此可见，随着PLAB浓度升高，G2/M期细胞比例明显增大并表现出时间依赖性，这说明PLAB可将SKOV3细胞阻滞于G2/M期。

2.4 SKOV3细胞Cyclin B1和CDK1 mRNA表达

通过相对定量法(2－△△Ct)计算各实验组 SKOV3细胞的相关基因表达(Tab 3)，5 μmol·L－1PLAB 作用SKOV3细胞12和24 h两个检测点中，Cyclin B1基因水平分别是对照组的1和50.75倍;CDK1基因水平分别是对照组的84.94和209.94倍;结果显示5 μmol·L－1PLAB 阻滞于 G2/M 时 Cyclin B1、CDK1呈高表达状态(P＜0.05)。

2.5 SKOV3细胞 Cyclin B1、CDK1 和 Cyclin D1蛋白表达 Western blot结果显示(Fig 3)，与对照组细胞相比，5 μmol·L－1PLAB 作用 SKOV3细胞 12、24 h后，细胞于G2/M阻滞的同时，可见细胞周期Cyclin B1、CDK1蛋白呈高表达状态，Cyclin D1蛋白呈低表达状态，差异有统计学意义(P＜0.05)，尤其以作用24 h处理组更为明显(P＜0.01)。

Fig 1 Morphologic changes of SKOV3cells treated with 5 μmol·L －1PLAB at different time points by fluorescence microscope(× 100)

Fig 2 Flow cytometric analysis of the cell cycle distribution in SKOV3cells of PLAB treatment at different time points

3 讨论

土槿乙酸的药理学研究及体内外实验均证实PLAB具有广泛的抗肿瘤活性，选择性抑制肿瘤细胞的生长，对正常细胞生长无影响［5－6］，活体无明显毒性。实验采用不同浓度PLAB作用于SKOV3细胞，MTT结果显示PLAB能抑制SKOV3细胞的生长，且抑制作用呈时间－浓度依赖性。

Tab 3 The Cyclin B1 and CDK1 mRNA levels of SKOV3cells treated with 5 μmol·L －1PLAB for different time by Real time-PCR(±s)

The PLAB groups were different significantly compared with control group，*P ＜0.05

Gene Relative amount(2－△△Ct)Exposure time/h 0 12 24 Cyclin B1 0.24 ±0.07 0.48 ±0.06 12.18 ±3.21*CDK1 0.03 ±0.02 2.82 ±0.21* 6.97 ±0.74*

文献报道，卵巢癌占女性恶性肿瘤的4%，是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，其5年生存率在早期患者为90%，晚期患者则不足30%［7］。研究表明在卵巢细胞发生恶性转化过程中，除了癌基因/抑癌基因正负调节失控外，细胞周期蛋白(Cyclins)也是参与卵巢细胞癌变过程的重要调控因子，其中Cyclin B1是与细胞G2/M检测点有关的重要细胞周期调控因子。生理情况下，体内外信号激活Cyclin B1后，Cyclin B1在S期开始合成并在G2期定位于细胞胞质，Cyclin B1的浓度在细胞内达到临界域值后结合CDK1并磷酸化CDK1Thr160/Thr161，形成异源二聚体Cyclin B1/CDK1，即细胞成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF)，进细胞从G2期进入M期，启动细胞有丝分裂［8］。Yu 等［9］证实 PLAB 可以增加核内Cyclin B1的表达，提高Cyclin B1从胞质向核内转运，并阻止核内的Cyclin B1降解，而核内Cyclin B1上调是M期周期阻滞的标志。Welsh等［10］应用寡核苷酸芯片在卵巢癌组织及SKOV3细胞系中检测到Cyclin B1和CDK1的高表达，Cyclin B1的过表达导致G2/M期关卡失控，使本来应停止增殖或生理性凋亡的细胞不停地进入细胞周期，因而造成恶性增殖，说明Cyclin B1有可能参与卵巢肿瘤发生及恶性进展。

Fig 3 The Cyclin B1，CDK1 and Cyclin D1 expression levels of SKOV3cells treated with 5 μmol·L －1PLAB for different time by Western blot

本实验结果证实:PLAB作用于SKOV3细胞后，随着药物浓度的升高和作用时间的延长，细胞G2/M期细胞比例明显升高。Western blot结果显示，5 μmol·L－1PLAB处理SKOV3细胞，随着时间进程，Cyclin B1和CDK1表达均上调，Cyclin D1表达下调。课题组推测PLAB引起SKOV3细胞Cyclin B1和CDK1表达升高，引发细胞内MPF分子的不断积聚，致大量处于S期时相的细胞进入G2/M期，同时缺乏介导处于G2/M期时相进入G0/G1期的Cyclin D1，因此，发生细胞周期G2/M期阻滞现象。是否PLAB阻止Cyclin B1降解从而使细胞阻滞于G2/M期尚需进一步研究。

［1］孟爱国，石峻，刘春艳，等.土槿乙酸抑制体外人胃癌细胞的生长［J］.基础医学与临床，2008，28(5):455－9.

［1］Meng A G，Shi J，Liu C Y，et al.Pseudoaric acid B inhibits growth of human gastric carcinoma cellsin vitro［J］.Bas Clin Med，2008，28(5):455－9.

［2］于静华，田代真一，小野寺敏，等.土槿皮乙酸不通过Fas途径诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡和M期周期阻滞［J］.中国药理学通报，2008，24(11):1509－13.

［2］Yu J H，TASHIRO Shin-ichi，ONODERA Satoshi，et al.Pseudolaric acid B induced apoptosis and mitotic arrest circumventing Fas receptor pathway in MCF-7 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(11):1509－13.

［3］程文龙，李晨光，马武男，等.土槿皮乙酸体外对前列腺癌PC-3细胞增殖的抑制作用及机制［J］.中药药理与临床，2011，27(1):9－13.

［3］Cheng W L，Li C G，Ma W N，et al.Inhibitions of pseudolaric acid B on prostate carcinoma PC-3 cells and its mechanism［J］.Chin Tradit Med Pharmacol Clin，2011，27(1):9－13.

［4］吴宝明，李俊，吕雄文，等.蜂毒素对SGC-7901细胞生长及G2/M期阻滞的影响［J］.中国药理学通报，2010，26(2):222－5.

［4］Wu B M，Li J，Lü X W，et al.Effects of melittin on the growth and G2/M phase arrest in SGC-7901 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(2):222－5.

［5］Wong V K，Chiu P，Chung S S，et al.Pseudolaric acid B，a novel microtubule-destabilizing agent that circumvents multidrug resistance phenotype and exhibits antitumor activityin vivo［J］.Clin Cancer Res，2005，11(16):6002－11.

［6］王辉，雷志勇，陈虹，等.土槿乙酸衍生物PB-LY体外抗肿瘤作用及其机制研究［J］.中国药理学通报，2008，24(9):1204－8.

［6］Wang H，Lei Z Y，Chen H，et al.Antitumor activity of PB-LY and its mechanismin vitro［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(9):1204－8.

［7］Parkin D M，Bray F，Ferlay J，Pisani P.Global cancer statistics 2002［J］.CA Cancer J Clin，2005，55(2):74－108.

［8］Stark G R，Taylor W R.Control of the G2/M transition［J］.Mol Biotechnol，2006，32(3):227－48.

［9］Yu J H，Cui Q，Jiang Y Y，et al.Pseudolaric acid B induces apoptosis，senescence，and mitotic arrest in human breast cancer MCF-7［J］.Acta Pharmacol Sin，2007，28(12):1975－83.

［10］Welsh J B，Zarrinkar P P，Sapinoso L M，et al.Analysis of gene expression profiles in normal and neoplastic ovarian tissue samples identifies candidate molecular markers of epithelial ovarian cancer［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(3):1176－81.?