淋球菌NspA核酸疫苗小鼠体内诱生保护性抗体研究

崔 婷

江苏省扬州市江都区仁和堂药房，江苏扬州 225200

淋球菌NspA核酸疫苗小鼠体内诱生保护性抗体研究

崔 婷

江苏省扬州市江都区仁和堂药房，江苏扬州 225200

目的 进一步研究前期构建淋球菌NspA真核细胞表达质粒pcNspA作为淋病核酸疫苗的可行性。方法 将pcNspA分别通过肌内注射（IM）、滴鼻（IN）和阴道接种（IVAG）等3种途径免疫BALB/c小鼠，对免疫鼠的血清、支气管肺泡和阴道洗液等样品分别用间接ELISA检测淋球菌特异性抗体的类型和效价，比较不同接种途径刺激小鼠体内特异性抗体水平的差异以及相应抗体的体外溶菌活性。结果pcNspA质粒经滴鼻免疫和肌内注射均可在小鼠体内诱导产生较高的特异性体液免疫水平，尤其是滴鼻免疫途径不仅可诱生较高水平的血清IgG抗体（1∶1 600），而且在支气管肺泡洗液和阴道洗液中均可检测到特异性sIgA的存在。而阴道接种pcNspA质粒仅能在阴道局部检测到较低水平的特异性sIgA。用pcNspA质粒诱生的血清IgG抗体做体外溶菌活性实验，证实滴鼻免疫小鼠血清具有溶菌活性。结论 淋球菌NspA基因疫苗可在小鼠体内诱导产生特异性抗体，并对机体有免疫保护作用；滴鼻可能是淋球菌NspA核酸疫苗的一个有效接种途径。

淋球菌；NspA；核酸疫苗；小鼠

淋病奈瑟菌（俗称淋球菌）是淋病的病原菌。随着抗生素的广泛使用，淋球菌的耐药性现象越来越严重，给淋病的治疗带来了极大困难[1]。因此，可有效预防淋球菌感染的理想疫苗研制目前尤为重要。已报道的一些淋球菌疫苗候选抗原如孔蛋白Por、菌毛蛋白Pil、菌落不透明相关蛋白Opa、脂寡糖Los等，均存在一度的变异性，因此人们一直在寻找具有免疫保护性的保守抗原。1999年Martin P等[2]首先克隆了淋球菌表面蛋白 A（neisseria surface protein A，NspA）的基因，并证明淋球菌菌株之间NspA氨基酸序列的同源性高达98%。用同位素标记的NspA单抗和淋球菌结合，证实NspA位于完整的细菌表面。本室构建了淋球菌NspA真核细胞表达质粒重组载体pcNspA[3]，本文将pcNspA经肌内注射、滴鼻和阴道接种3种途径核酸免疫BALB/c小鼠，研究了NspA核酸免疫在小鼠体内诱生特异性抗体的作用。

1 资料与方法

1.1 菌株、质粒和实验动物

DH5α大肠杆菌、NspA真核表达载体pcNspA由扬州大学医学院提供[3]。4～6周龄BALB/c小鼠（雌性，体重约19 g）由扬州大学比较医学中心提供，生产许可证号：SCXK（苏）2002-0009，使用许可证号：SCXK（苏）2002-0045。 将 50 只 6周龄雌性BALB/c小鼠随机分成5组，每组10只。分别记作空白对照组（PBS）、阴性对照组（pCMV-script）、pcNspA 肌内注射组（IM）、pcNspA 滴鼻免疫组（IN）、pcNspA 阴道接种组（IVAG）。

1.2 主要试剂

PEI（25kDa） 为Sigma公司产品；Columbia Agar为法国bioMérierx sa公司产品；HRP标记的兔抗鼠IgA购自USB公司，羊抗鼠IgG的HRP酶标二抗购自北京华美生物工程公司。

1.3 免疫小鼠

大量提取质粒pcNspA和pCMVScript，免疫时重组质粒与 PEI按 1∶2的质量比混匀，37℃放置 15 min后免疫小鼠。第0、2、3和4周分别免疫1次。IM组于每次免疫前24 h先在每只小鼠股四头肌注射0.25 mg蔗糖，然后于相同部位注射100 μg质粒；IN组小鼠先用乙醚麻醉后再将100 μg质粒缓慢滴进每只小鼠鼻腔；IVAG组先轻轻按摩刺激小鼠排泄粪便，然后将质粒以100 μg/只剂量用移液器注入小鼠阴道。

1.4 样本收集

最后一次免疫后2周分别收集各免疫组小鼠的血清、支气管肺泡和阴道洗液等样本。收集血清：摘除眼球取血，37℃孵育2 h，12 000×g离心5 min后吸取上清；收集阴道洗液：以200 μL PBS缓慢冲洗阴道约9次，收集的洗液经12 000×g离心10 min后吸取上清[4]；收集支气管肺泡洗液：脱颈椎处死小鼠，于气管环状软骨处切一小口，用30 μL PBS缓慢冲洗肺部3次，收集洗液，12 000×g离心5 min后取上清[5]。上述样本均于-70℃贮存备用。

1.5 全细胞ELISA

按文献[2]方法进行。收集培养18 h的淋球菌细胞，以生理盐水悬浮后分光光度计调整至OD600=1.0。取 100 μL菌悬液置于微孔板的小孔中，37℃过夜烘干，PBST洗涤3次。用含3%小牛血清蛋白的PBS封闭，37℃孵育30 min后弃去封闭液，PBST洗涤3次。每孔加入系列稀释的100 μL待测样品，37℃孵育1 h后用PBST洗涤3次。每孔加入100 μL HRP标记的兔抗鼠IgA稀释液或羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h，PBST洗涤3次。加显色底物溶液100 μL，15 min后加显色终止液，用酶标仪读取A490值。空载体免疫的小鼠样本作为阴性对照，P/N≥2.1时样品的最大稀释倍数作为特异性抗体的效价。

1.6 补体依赖性抗体杀菌实验

按文献[6]方法进行实验：将400 CFU淋球菌和小鼠抗血清混合，并加入新鲜人血清作为补体，100 μL反应体系中抗血清的稀释稀释度分别为 1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280，人血清浓度均为10%。37℃孵育30 min后将反应液铺于淋球菌琼脂平板，于36℃的二氧化碳培养箱中培养约20 h，计数平板上长出的淋球菌菌落。1∶80空载体免疫鼠血清为阴性对照。

1.7 统计学分析

实验数据用SPSS 10.0软件进行方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清中特异性IgG水平

间接ELISA检测不同免疫途径诱生小鼠血清中淋球菌特异性IgG水平，结果见图1，以IM、IN和IVAG等3种途径分别给小鼠免疫pcNspA后，IM组和IN组小鼠血清中淋球菌特异性IgG抗体效价最高，均可达到1∶1 600，两组小鼠血清中特异性IgG抗体水平差异无统计学意义 （P>0.05），但与IVAG组差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 血清中特异性IgA水平

间接ELISA检测不同免疫途径诱生小鼠血清中淋球菌特异性IgA水平，结果表明IM与IN组小鼠血清中特异性IgA水平相近，均高达1∶1 600，二者差异无统计学意义（P>0.05），但二者均与IVAG组差异有统计学意义（P<0.05）（图2）。

2.3 支气管肺泡和阴道洗液中特异性sIgA水平

由表1可见，IN组小鼠支气管肺泡洗液中特异性sIgA水平最高（120±75）；IM 小鼠次之（100±77）；IVAG 组小鼠未检测到支气管肺泡洗液洗液中的特异性sIgA。

IN组和IVAG组小鼠的阴道洗液中可检测到一定效价的特异性sIgA，二者差异无统计学意义（P>0.05）；IM组小鼠未检测到阴道洗液中的特异性sIgA。

表1 不同接种途径刺激小鼠产生的淋球菌特异性sIgA水平（±s）Tab.1 The titer of gonococcus specific sIgA in lung lavage fluids and vaginal fluids from mice immunized by pCNspA via different routes，respectively(±s)

表1 不同接种途径刺激小鼠产生的淋球菌特异性sIgA水平（±s）Tab.1 The titer of gonococcus specific sIgA in lung lavage fluids and vaginal fluids from mice immunized by pCNspA via different routes，respectively(±s)

组别 肺泡洗液sIgA效价 阴道洗液sIgA效价PBS control pCMV-script pcNspA IN pcNspA IM pcNspA IVAG－ －－ －120±75 100±77－100±65－100±60

2.4 免疫小鼠抗血清的补体依赖性杀菌活性

根据ELISA检测上述样品中特异性抗体的效价，选用IN组小鼠抗血清进行抗体介导的补体溶菌活性试验。由图3可以看出，不同稀释度的免疫血清均具有一定的抗菌活性，而1∶80稀释的血清表现的溶菌活性最强。

3 讨论

Por、Pil、Opa和LOS等淋球菌抗原均有较高的变异性，而NspA则高度保守，是淋病有效疫苗的理想候选抗原。本研究利用前期构建的pcNspA，比较了3种不同接种途径核酸免疫小鼠诱生的特异性抗体效价及抗菌活性，为淋病疫苗研制奠定了实验基础。

IM可刺激机体产生较强的全身性免疫反应，也是核酸疫苗的首选接种途径，淋病疫苗研究中也大都采用基因枪或注射方法进行肌肉免疫[6-7]。但IM免疫诱导的黏膜免疫效果并不理想[8]，而淋球菌正是通过黏膜系统造成泌尿生殖道、眼结膜、咽部或者直肠等局部感染。本研究中，笔者发现肌内注射pcNspA的小鼠血清中产生了较高水平的淋球菌特异性IgG和IgA，支气管肺泡洗液中可诱生一定的sIgA，但阴道洗液中未能检测到sIgA。

IN简便易行、相对安全，可诱生较强的全身性免疫，黏膜免疫反应水平也较高[8]，可在小鼠下生殖道诱生抗原特异性抗体[9]。小鼠鼻腔后部双侧具有条形鼻黏膜相关淋巴组织[10]，与人类Waldeyer's环相似，是上呼吸道的免疫诱导部位。基因疫苗被吸附到鼻腔黏膜上皮后可被M细胞摄取并跨膜运送到鼻相关淋巴组织，然后致敏的淋巴细胞通过循环系统迁移到其他的黏膜效应部位产生免疫应答。本实验的结果表明滴鼻免疫组小鼠的血清IgG及IgA、支气管肺泡洗液sIgA和阴道洗液sIgA与对照组相比都差异有统计学意义，而且滴鼻免疫组诱导产生的血清特异性IgG、IgA水平与肌内注射免疫组相比差异无统计学意义，表明滴鼻免疫NspA基因不仅可以和传统的肌内注射方法一样有效地诱导机体产生体液免疫，还能在黏膜系统诱导免疫应答，发挥更强大的免疫保护作用。

阴道接种是另一种黏膜免疫途径，尽管还没有证据表明在阴道黏膜有淋巴滤泡或者M细胞的存在，但阴道黏膜免疫接种可以在阴道局部产生免疫应答[11]。不过以现有的免疫佐剂和免疫方案，在啮齿类动物进行阴道免疫接种的免疫效果不佳[12-13]，可能因为生殖道的局部免疫应答很大程度上受到鼠类体内激素水平的影响，其免疫应答水平随着机体动情期的改变而改变。在本实验中，小鼠阴道途径接种NspA基因疫苗后，仅在阴道洗液中发现存在少量特异性sIgA，不能诱导系统免疫应答。

在对淋球菌疫苗的研究过程中，一般认为特异性抗体的补体依赖性杀菌作用是疫苗可产生保护性的有力证据[6]，在缺少合适的实验动物模型的现状下，体外杀菌试验的结果不仅可以评估特异性抗体对机体免疫保护作用，还可以进而了解到该疫苗对潜在的外来细菌入侵的清除防范能力。对滴鼻免疫小鼠血清中的NspA特异性抗体做进一步的功能研究，显示产生的特异性抗体可以在体外介导补体发挥溶解细菌的作用。

综上所述，淋球菌NspA核酸疫苗的免疫原性较强，可诱导小鼠产生淋球菌特异性保护性抗体。与其他接种途径相比，IN免疫诱导的全身性和黏膜免疫应答均最强，是淋病核酸疫苗的有效接种途径。

[1]Stefanelli P.Emerging resistance in Neisseria meningitidis and Neisseria gonorrhoeae[J].Expert Rev Anti Infect Ther，2011，9（2）：237-244.

[2]Martin P，Nathalie C，Rioux CR，et al.Antigenic and molecular conservation of the gonococcal NspA protein[J].Infection and Immunity，1999，67（6）：2855-2861.

[3]季明春，陈红菊.奈瑟氏淋球菌表面蛋白A基因克隆及在真核细胞中的表达研究[J].微生物学报，2004，44（1）：44-46.

[4]张欣，陈磊，陶欣，等.HIV-1CN54 DNA疫苗滴鼻免疫小鼠诱发系统和黏膜免疫应答[J].免疫学杂志，2003，19（6）：415-419.

[5]Ichinohe T，Ainai A，Nakamura T，et al.Induction of cross-protective immunity against influenza A virus H5N1 by an intranasal vaccine with extracts of mushroom mycelia[J].J Med Virol，2010，82（1）：128-137.

[6]Zhu W，Thomas CE，Sparling PF.DNA immunization of mice with a plasmid encoding Neisseria gonorrhoeae PorB protein by intramuscular injection and epidermal particle bombardment[J].Vaccine，2004，22（5-6）：660-669.

[7]Bos MP，Tefsen B，Voet P，et al.Function of neisserial outer membrane phospholipase a in autolysis and assessment of its vaccine potential[J].Infect Immun，2005，73（4）：2222-2231.

[8]Jabbal-Gill I.Nasal vaccine innovation[J].J Drug Target，2010，18（10）：771-786.

[9]Lu L，Palaniyandi S，Zeng R，et al.A neonatal Fc receptor-targeted mucosal vaccine strategy effectively induces HIV-1 antigen-specific immunity to genital infection[J].J Virol，2011，85（20）：10542-10553.

[10]Canessa C，Vierucci S，Azzari C，et al.The immunity of upper airways[J].Int J Immunopathol Pharmacol，2010，23（1 Suppl）：8-12.

[11]Carmichael J R，Pal S，Tifrea D，et al.Induction of protection against vaginal shedding and infertility by a recombinant Chlamydia vaccine[J].Vaccine，2011，29（32）：5276-5283.

[12]Russell MW.Immunization for protection of the reproductive tract：a review[J].Am J Reprod Immunol，2002，47（5）：265-268.

[13]Wegmann F，Krashias G，Luhn K，et al.A novel strategy for inducing enhanced mucosal HIV-1 antibody responses in an anti-inflammatory environment[J].Plos One，2011，6（1）：e15861.

Study on the protective antibodies induced in mice by nucleic acid vaccine of neisseria gonorrhoeae NspA

CUI Ting
Renhe Tang Pharmacy of Jiangdu District of Yangzhou City in Jiangsu Province,Yangzhou 225200,China

Objective To further study the feasibility of constracting express plasmid pcNspA of eukaryotic cell of neisseria gonorrhoeae NspA in the earlier stage.Methods The BALB/c mice were immunized with pcNspA in three different ways of intramuscular injection(IM),nasal drip(IN)and vaginal vaccination(IVAG)respectively.The samples like serum,bronchoalveolar and vaginal lotion of immunized mice were respectively used by indirect detection of ELISA to detect the types and valence of specific antibodies of neisseria gonorrhoeae.The differences of the level of specific antibodies in mice and the bacteriolytic activities in vitro of corresponding antibodies stimulated by different routes of inoculation were compared.Results The plasmid pcNspA could induce higher specific humoral immune level in mice by both ways of nasal drip and intramuscular injection.Specially,the immunization route of nasal drip not only could induce higher level of serum IgG antibodies(1∶1 600),but also could detect the existence of specific sIgA in both bronchioloalveolar lotion and vaginal lotion.While vaginal inoculation pcNspA plasmid could only detect lower level of specific sIgA in local vagina.The serum IgG antibodies induced by pcNspA plasmi was used to carry on the experiment of bacteriolytic activities in vitro,which showed that there were hypha activities in the serum of mice immunized by nasal drip.Conclusion The neisseria gonorrhoeae NspA can induce specific antibodies in mice,and has an immunity protection for organism.The nasal drip may be an effective vaccination way of nucleic acid vaccine of neisseria gonorrhoeae NspA.

Neisseria gonorrhoeae;NspA;Nucleic acid vaccine;Mice

R-332

A

1674-4721（2012）08（c）-0005-03

2012-05-11 本文编辑：赵丽萍）