间充质干细胞和免疫抑制剂的相互作用

赵红州 黄梁浒

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于中胚层的具有自我更新和多向分化潜能的干细胞，几乎存在于人体所有组织，最早从骨髓中分离得到[1-3]。研究发现，MSCs免疫原性弱，体外不诱发免疫应答［4-6］，而且MSCs具有独特的多谱系分化特性和天然的免疫抑制与调节功能，以及强大的组织修复能力［1］，凸显其作为种子细胞应用于再生医学的潜能。实体器官移植是治疗重要脏器功能衰竭的主要方法，而免疫抑制剂的广泛使用提高了移植物的存活率，但同时也带来感染增加、毒副作用强等不良后果[7]。MSCs作为免疫调节剂，通过抑制淋巴细胞增殖、抑制抗原呈递细胞分化成熟而发挥其独特的免疫抑制作用，使其在器官移植方面显现出潜在优势和良好应用前景[8-11]。但是由于MSCs广泛存在，一方面在移植中MSCs不可避免地会曝露在免疫抑制药物作用之下，使其免疫调理的作用受到影响[9，12]；另一方面MSCs表达多种免疫抑制剂的分子作用靶位，如钙神经素（calcineurin，CNI）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）和肌苷5'-磷酸脱氢酶（inosine 5'-monophosphate dehydrogenase，IMPDH），免疫抑制剂与其受体结合后作用于上述分子作用靶位，从而影响MSCs的生物学特性及其功能[13-15]。但两者之间相互影响究竟如何以及二者相互作用的机制尚无定论，本文就这些方面研究作一综述。

一、免疫抑制药物对MSCs的影响

1.免疫抑制药物对MSCs多向分化潜能的影响：体外实验证实，免疫抑制药物可以影响MSCs诱导成成骨细胞、成脂肪细胞等的能力[1，16-20]。在MSCs培养体系中加入免疫抑制剂CNI类[环孢素A（cyclosporin A，CsA）与他克莫司]、霉酚酸（mycophenolic acid，MPA）和雷帕霉素共培养，免疫抑制剂基本不影响MSCs的免疫表型，而影响其向成骨细胞、成脂肪细胞分化的能力。在MSCs成骨、成脂诱导体系中分别加入不同浓度梯度的免疫抑制剂他克莫司（1，10，100 ng/ml）、MPA（1，10，100 μg/ml）、雷帕霉素（0.1，1，10，50 ng/ml）和CsA(10，100，500 ng/ml)。结果显示成骨诱导体系对照组有明显的钙盐矿物质沉积，而加入不同浓度梯度MPA和他克莫司处理组钙盐沉积减少，尤其是加入MPA浓度在10 μg/ml时钙盐沉积减少最明显，表明上述两种免疫抑制剂抑制了MSCs向成骨细胞分化，而雷帕霉素对MSCs成骨分化的影响无统计学差异。与成骨诱导结果相反，在MSCs向成脂诱导分化时，雷帕霉素明显增强了MSCs的成脂能力，而MPA和他克莫司对其成脂无明显的影响[18-23]。

2.免疫抑制药物对MSCs免疫调节作用的影响：Buron等[21]证实体外MSCs表达免疫抑制活性。在混合淋巴细胞反应体系中，反应细胞和刺激细胞皆来源于人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，加入第 三 方MSCs细胞做混合淋巴细胞培养，结果显示MSCs以一种剂量和时间依赖的方式，而非MHC限制的方式抑制T淋巴细胞增值。研究发现在MSCs抑制T细胞增殖的分子机制中，与MSCs共培养的T细胞周期被抑制在G0/G1期，T细胞中促进G1/S期转换的周期蛋白CyclinD2表达下调，而抑制细胞增殖的蛋白p27KiPl上调，MSCs 的这种调节作用并不是针对T细胞某个亚群，而是抑制所有种类的 T 细胞增殖[17，23-28]。

在混合淋巴细胞反应体系中将作为第三方的MSCs与PBMC来源的反应细胞以终浓度分别为1:20、1:10和1:5之比例混合，并加入不同浓度梯度的免疫抑制剂（含正常血药浓度）共培养。结果表明当两者比值为1:20时，MSCs对淋巴细胞增殖的抑制作用有限，淋巴细胞增殖被抑制的程度不足50﹪，然而CsA、MPA、他克莫司和雷帕霉素等免疫抑制剂都随着药物浓度增加以剂量依赖的方式增强MSCs对T细胞的免疫抑制效应；然而MSCs与反应细胞比值为1:10和1:5时，MSCs自身就成了一种强免疫抑制剂，对淋巴细胞增殖起到抑制作用，这种情形下药物对MSCs作用表现出多样性：（1）CsA出现拮抗MSCs抑制效应的现象，两者比值1:10时，在无免疫抑制剂存在的情况下MSCs自身抑制80﹪的淋巴细胞增殖，使得淋巴细胞增殖水平只有对照组的20﹪，然而在加入10 ng/ml或100 ng/ml CsA后MSCs对淋巴细胞增殖的抑制作用减弱，淋巴细胞增殖水平为对照组的40﹪，MSCs与反应细胞比值1:5时一样；（2）他克莫司、雷帕霉素对MSCs的作用类似CsA；（3）MPA促进MSCs抑制作用，MSCs与反应细胞比值1:10或1:5时，MPA随着剂量的增加对MSCs表现出协同作用，促进其抑制增殖作用［18，29］。

3.免疫抑制药物对MSCs细胞活性的影响：MSCs 5000/孔种植于96孔板，分别加入1，10，100 ng/ml他克莫司，1，10，100 μg/mlMPA，0.1，1，10，50 ng/ml雷帕霉素，在标准条件下共培养24 h和7 d，用MTT法检测活细胞数量。结果发现24 h内几种药物对MSCs存活几乎无影响；当MSCs与上述药物共培养了7 d后，观察结果提示他克莫司在浓度100 ng/ml时能显著降低MSCs活细胞数量，而MPA在浓度100 μg/ml时也能够降低MSCs的活细胞数量，但程度比他克莫司弱的多[21-23，30]。

MSCs以2×105/孔种植于6孔板，分别加入10 ng/ml他克莫司、10 μg/ml MPA、10 ng/ml雷帕霉素，不加药物组作为对照均在标准培养条件下培养，分别培养至第48小时和第7天，胰酶消化，收集细胞，使用凋亡检测试剂盒annexin V染色，流式细胞仪检测凋亡细胞比值。结果发现3种药物分别对MSCs凋亡的影响与对照组差异无统计学意义[30-32]。

4.免疫抑制药物对MSCs细胞增殖的影响：MSCs以103/孔种植于96孔板，在MSCs培养体系分别加入上述不同浓度免疫抑制药物，以培养到第3天和第7天作为观察时间点。在观察前12h分别掺入0.5 uCi /孔3H-胸腺嘧啶脱氧核苷，以闪烁计数仪对增殖细胞分别定量测定MSCs的增殖情况。结果发现他克莫司对MSCs的增殖影响差异无统计学意义；3种不同浓度的MPA均能显著降低MSCs增殖能力，第3天测定时在浓度10 μg/ml时MSCs增殖能力降低最明显，降低了90﹪，第7天时结果相似；雷帕霉素则以一种剂量依赖的方式影响MSCs增殖，其浓度大于10 ng/ml时能显著降低MSCs增殖[32-34]。

二、MSCs对免疫抑制药物的影响

MSCs在达到一定的浓度时，也表现出强的免疫抑制活性[9-10，22]。Bartholomew 等[35]对进行皮肤移植的狒狒输注供者狒狒的MSCs，发现可延长移植皮肤的存活时间，其效果可和环孢素媲美；即便是第三方来源的MSCs也有类似效果。对异体活体肝移植狗的研究发现，对照组仅做活体肝移植，处理组在活体肝移植的基础上，经门静脉输注自体骨髓 MSCs，输注 MSCs组具有更长的生存率(P < 0.001)，肝功能指标更低 (P < 0.01)，但MSCs输注组与对照组相比排斥反应发生率相似。在肾移植等其他实体器官移植的试验中也有相关使用MSCs可减低排斥反应发生率的报道。MSCs减轻实体器官移植排斥反应的机制比较复杂，在心脏移植的动物试验中发现，MSCs可移行至发生慢性排斥反应的异体心脏，因此推测MSCs可能具有局部免疫抑制作用[33]。

由于MSCs具有免疫抑制活性，与免疫抑制药物一同作用发挥免疫抑制活性时可能会出现协同增强作用或拮抗作用，抑或相互无影响。在混合淋巴细胞反应，MSCs对低浓度的免疫抑制药物的免疫抑制效应有促进作用；MSCs拮抗高浓度的CNI类免疫抑制剂的免疫抑制效应，但是CsA在500 ng/ml工作浓度时，MSCs对其无影响；MSCs与MPA有协同效应，MSCs能够增强MPA对淋巴细胞增殖的抑制效应，在大鼠心脏移植试验中发现，MSCs结合低剂量MPA，可诱导心脏异体移植后动物的免疫耐受，试验组大鼠的移植心脏平均存活时间达100d以上，而对照组仅为13d。实验还发现，MSCs与MPA协同效应与MPA浓度无相关性[22，31]。

三、MSCs免疫抑制活性的机制和MSCs与免疫制剂相互作用的可能机制

图1 MSCs与其他免疫细胞的相互作用[30]

尽管靶细胞和MSCs通过直接接触相互作用是MSCs发挥免疫抑制活性的一个重要因素，但细胞与细胞之间直接接触并非必需。通过其他免疫细胞分泌的多种细胞因子共同活化MSCs，诱导其分 泌 如 INF-γ、TGF-β、PGE-2、IL-10、TNF-α、IL-1、NO等多种可溶性炎症因子从而发挥其免疫抑制活性被认为是MSCs发挥其免疫抑制作用的主要机制（图1）。低浓度IFN-γ可上调MSCs表面MHCⅡ类分子的表达，但随着IFN-γ的水平升高，其Ⅱ类分子的表达量降低，其抗原提呈能力也逐渐下降。这使得MSCs在免疫反应早期，IFN-γ水平较低时，表现为APC的功能，随着IFN-γ水平的增高 ，MSCs的功能就转化为免疫抑制了[23，28]。有文献报道MSCs体外能调节B细胞、T细胞、DC细胞和NK细胞活性。T淋巴细胞是实体器官移植排异的关键效应细胞。体外试验也表明MSCs对CD8+T淋巴细胞和CD4+T淋巴细胞有抑制作用，MSCs体外可抑制T细胞增殖，诱导CD4+T细胞向Th2方向分化，并可诱导出具有抑制功能的T细胞亚群，从而阻断T细胞对刺激细胞的应答，阻断前体T细胞发育为CD8+T细胞，且抑制CD8+T细胞的杀伤功能，体内抑制记忆性T细胞的增殖、细胞毒性反应，以及抑制产生IFN-γ的T细胞数量等，但有关体内MSCs对T淋巴细胞的影响，受目前资料所限尚无确切证据。树突状细胞（dendritic cells ，DC）在实体器官移植排斥反应中起着重要作用，MSCs可以通过改变DC的成熟度，促进其向调节性表型转化，因此很有可能以此影响DC的功能，达到免疫抑制的作用。对小鼠和人类 MSCs的体外研究发现MSCs还可以抑制B淋巴细胞的增殖、分化和趋化作用，且这种作用至少部分地与可溶性因子有关，如INF-γ、TGF-β 等[23-28，36-38]。

研究证实，MSCs表达多种免疫抑制剂的分子作用靶位，如CNI、mTOR和IMPHD等。（1）CNI在MSCs和T细胞上都有表达，能够活化T细胞并且在MSCs成骨、成软骨分化过程中起重要作用，而他克莫司和CsA则是CNI的抑制剂，二者通过抑制CNI活性，破坏在T细胞活化方面起重要作用的细胞因子如IL-2、IL-4等基因的表达，从而阻断T细胞活化，并抑制MSCs成骨、成软骨分化；（2）mTOR是雷帕霉素的分子作用靶位，mTOR与雷帕霉素结合后能够通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，阻断MSCs由G1期至S期的进程，在MSCs增殖、分化和存活等过程中起到重要作用；（3）作为细胞周期阻断剂的活性代谢产物之一的MPA，其分子作用靶位为IMPHD，而且发现MPA能够显著抑制MSCs增殖，其可能机制是：IMPHDⅡ亚型仅表达于活化的淋巴细胞和MSCs，而且MSCs高表达Ⅱ亚型，其他细胞则只表达IMPHD Ⅰ亚型，有文献报道MPA与IMPHD Ⅱ亚型的亲和力显著强于IMPHD I亚型，因此MPA对Ⅱ亚型的抑制作用也强于Ⅰ亚型，MPA对MSCs则表现为显著抑制其增殖、分化[21-24，38]。综上所述，免疫抑制剂通过与MSCs上表达的多种免疫抑制剂的分子作用靶位相结合，从而发挥其免疫抑制效应，这可能就是免疫抑制剂抑制MSCs增殖、分化和影响MSCs细胞周期的一种机制。

目前免疫抑制剂与MSCs两者相互作用机制尚无定论，但目前存在一个得到多数研究人员认可的假说：CNI类抑制淋巴细胞的活化和炎症因子的释放，这些炎症因子尤其是IFN-γ和炎性微环境是MSCs发挥免疫抑制效应必须的，因此，CNI类通过抑制其他免疫细胞释放MSCs活化必须的炎症因子和抑制炎性微环境，从而表现出抑制MSCs活化、增殖、分化和存活的效应[21-24，29]。MSCs分泌释放INF-γ、TGF-β、IL-10 等可溶性炎症因子，在与免疫抑制剂一同作用时可能会出现协同增强作用或拮抗作用。

四、总结与展望

由于MSCs的免疫抑制和免疫调节性，使其成为有良好应用前景的器官移植治疗新手段。而且在骨髓移植中还发现同源性MSCs能促进移植物植入和降低移植排斥的发生，异源性MSCs阻碍移植物植入[39]。虽然目前MSCs的相关研究结果令人鼓舞，但仍有大量问题无法回避：（1）MSCs的来源：尽管源于骨髓、脂肪、脐带等的 MSCs功能相似，但不同来源的MSCs其某些CD分子表达不完全一致，且脂肪来源的MSCs在传代过程中相对容易出现染色体改变[40-41]；（2）干细胞的定位和作用机制仍然不清楚，干细胞进入血循环后，如何通过肾小球基底膜屏障到达靶部位进行分化和修复，也是亟待解决的问题[42]；（3）在实体器官移植中免疫抑制剂和MSCs相互影响，有的与MSCs表现协同作用，而有的与MSCs相互拮抗，两者之间的作用机制有待进一步阐明，如何用药、如何规避风险提高移植器官存活率等尚无统一的观点。尽管如此，关于MSCs的研究目前已然成为临床热点。随着基础研究的深入及临床试验资料的不断完善，MSCs作为一种新的免疫调节剂展现良好的应用前景，将可能成为一种理想的细胞治疗手段。

1 杨顺良,谭建明.间充质干细胞的免疫调节作用及其在实体器官移植中的应用[J].中华器官移植杂志,2011,32(9):566-569.

2 Bianco P,Robey PG,Simmons PJ.Mesenchymal stem cells:revisiting history concepts and assays[J].Cell Stem Cell,2008,2 (4): 313-319.

3 Hoogduijn MJ,Crop MJ,Peeters AM,et al.Human heart,spleen,and perirenal fat-derived mesenchymal stem cells have immunomodulatory capacities[J].Stem Cells Dev,2007,16(4): 597-604

4 Uccelli A,Moretta L,Pistoia V.Mesenchymal stem cells in health and disease[J].Nat Rev Immunol,2008,8(9):726-736.

5 Poncelet AJ,Hiel AL,Vercruysse J,et al.Intracardiac allogeneic mesenchymal stem cell transplantation elicits neoangiogenesis in a fully immunocompetent ischaemic swine model[J].Eur J Cardiothorac Surg,2010,38(6):781-787.

6 Sotiropoulou PA,Perez SA,Gritzapis AD,et al.Interactions between human mesenchymal stem cells and natural killer cells [J].Stem Cells,2006,24(1):74- 85.

7 Dahlke MH,Hoogduijn M,Eggenhofer E,et al.Toward MSC in solid organ transplantation:2008 position paper of theMISOT study group[J].Transplantation,2009,88(5):614-619.

8 Eggenhofer E,Renner P,Soeder Y,et al.Features of synergism between mesenchymal stem cells and immunosuppressive drugs in a murine heart transplantation model[J].Transpl Immunol,2011,25(2-3):141-147.

9 Hoogduijn MJ,Popp FC,Rowshani AT,et al.Advancement of mesenchymal stem cell herapy in solid organtransplantation(MISOT)[J].Transplantation,2010,90(2):124–126.

10 Pan H,Zhao K,Wang L,Zheng Y,et al.Mesenchymal stem cells enhance the induction of mixed chimerism and tolerance to rat hindlimb allografts after bone marrow transplantation[J].J Surg Res, 2010,160(2):315-324.

11 Ge W,Jiang J,Baroja ML,et al.Infusion of mesenchymal stem cells and rapamycin synergize to attenuate alloimmune responses and promote cardiac allograft tolerance[J].Am J Transplant,2009,9(8):1760–1772.

12 Sel mani Z,NajiA,Zidi I ,et al.Human leukocyte antigen-G5 secret on by human mesenchymal stem cells is required to suppress T lymphocyte and natural killer functi on and to induce CD4+/CD25 high FOXP3+ regulatory T cells[J].Stem Cells,2008,26(1):212-222.

13 Angoulvant D,Ivanes F,Ferrera R,et al.Mesenchymal stem cell conditioned media attenuates in vitro and ex vivo myocardial reperfusion injury[J].J Heart Lung Transplant,2011,30(1):95-102.

14 Itakura S,AsariS,Rawson J,et al.Mesenchymal stem cells facilitate the induction of mixed hematopoietic chimerism and islet allograft tolerance without GVHD in the rat[J].Am J Transplant，2007，7(2) : 336- 346.

15 Rosso Felipe C,de Sandes TV,Sampaio EL,et al.Clinical impact of polymorphisms of transport proteins and enzymes involved in the metabolism of immunosuppressive drugs[J].Transplant Proc,2009,41(5):1441-1455.

16 Mao F,Xu WR,Qian H,et al.Immunosuppressive effects of mesenchymal stem cells in collagen induced mouse arthritis[J].In flamm Res,2009,59(3):219-225.

17 Gonzalez MA,Gonzalez-Rey E,Rico L,et al.Treatment of experimental arthritis by inducing immune tolerance with human adipose derived mesenchymal stem cells[J].Arthritis Rheum,2009,60(4):1006-1019.

18 Poncelet AJ,Nizet Y,Vercruysse J,et al.Inhibition of humoral response to allogeneic porcine mesenchymal stem cell with 12 days of tacrolimus[J].Transplantation,2008,86(11):1586-1595

19 Zhang W,Qin C,Zhou ZM.Mesenchymal stem cells modulate immune responses combined with ciclosporine in a rat transplantation model[J].Transplant Proc,2007,39(10):3404-3408.

20 Popp FC,Eggenhofer E,Renner P,et al.Mesenchymal stem cells can induce long-term acceptance of solid organ allografts in synergy with low-dose mycophenolate[J].Transplant Immunol,2008,20(1-2):55-60.

21 Buron F,Perrin H,Malcus C,et al.Human mesenchymal stem cells and immuno- suppressive drug interactions in allogeneic responses:an in vitro study using human cells[J].Transplant Proc,2009,41(8):3347–3352.

22 HoogduijnMJ,Crop MJ,Korevaar SS ,et al.Susceptibility of human mesenchymal stem cells to tacrolimus,mycophenolate acid and rapamycin[J].Transplantation,2008,86(9):1283-1291.

23 AugelloA,Tasso R,Negrini SM,et al.Bone marrow mesenchymal progenitor cells inhibit lymphocyte proliferation by activation of the programmed death pathway[J].Eur J I mmunol,2005,35 (5):1482-1490.

24 Hoogduijn MJ,Roemeling-van Rhijn M,Korevaar SS,et al.Immunological Aspects of Allogeneic and Autologous Mesenchymal Stem Cell Therapies.Hum Gene Ther,2011,22(12):1587-1591.

25 Weng JY,Du X,Geng SX,et al.Mesenchymal stem cell as salvage treatment for refractory chronic GVHD[J].Bone Marrow Transplant,2010,45 (12):1732-1740.

26 Kuci S,Kuci Z,Kreyenberg H,et al.CD271 antigen defines a subset of multipotent stromal cells with immunosuppressive and lymphohematopoietic engraftment promotoing properties [J].Haematologica,2010,95(4):651-659.

27 Benvenuto F,Ferrari S,Gerdoni E,et al.Human mesenchymal stem cells promote survival of T cells in a quiescent state[J].Stem Cells,2007,25(7):1753-1760.

28 Sheng H,Wang Y,Jin Y,et al.A critical role of IFN in priming MSC mediated suppression of T cell proliferation through up regulation of B7- H1[J].Cell Res,2008,18(8):846-857.

29 Eggenhofer E,Steinmann J F,Renner P,et al.Mesenchymal stem cells together with mycophenolate mofetil inhibit antigen presenting cell and T cell in fltration into allogeneic heart grafts[J].Transpl Immunol,2011,24(3):157–163.

30 Ghannam S,Bouffi C,Djouad F,et al.Immunosuppression by mesenchymal stem cell: mechanism and clinical applications[J].Stem Cell Res Ther,2010,1(1):2-7.

31 Popp FC,Eggenhofer E,Renner P,et al.Mesenchymal stem cells can induce long-term acceptance of solid organ allografts in synergy with low-dose mycophenolate[J].Transpl Immunol, 2008,20(1-2):55-60.

32 Lee WS,Suzuki Y,Graves SS,et al.Canine bone marrowderived mesenchymal stromal cells suppress alloreactive lymphocyte proliferation in vitro but fail to enhance engraftment in canine bone marrow transplantation[J].Biol Blood Marrow Transp,2011,17(4):465-475.

33 Spaggiari G M,Capobianco A.Mesenchymal stem cells inhibit natural killer cell proliferati on cytotoxicity,and cytokine production: role of indoleamine 2,3-dioxygenase and prostaglandin E2[J].Blood,2008,111(3):1327-1333.

34 Poncelet AJ,Hiel AL,Vercruysse J,et al.Intracardiac allogeneic mesenchymal stem cell transplantation elicits neo-angiogenesis in a fully immunocompetent ischaemic swine model[J].Eur J Cardiothorac Surg ,2010,38(6):781-787.

35 Bartholomew A,Sturgeon C,SiatskasM,et al.Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo[J].Exp Hematol,2002,30(1):42-48.

36 Bestard O,Cruzado JM,Mestre M,et al.Achieving donor specific hyporesponsiveness is associated with FOXP3+regulatory T cell recruitment in human renal allograft infiltrates[J].J Immunol,2007,179(7):4901-4909.

37 包新杰,王任直.间充质干细胞的免疫学特性[J].J Med Res,2011,40(5):144-147.

38 Han Z,Jing Y,Zhang S,et al.The role of immunosuppression of mesenchymal stem cells in tissue repair and tumor growth[J].Cell Biosci,2012,2(1):8-10.

39 Kebriaei P,Isola L,Bahceci E,et al.Adult human mesenchymal stem cells added to corticosteroid therapy for the treatment of acute graft-versus-host disease[J].Biol Blood Marrow Transplant,2009,15(7):804-811.

40 Sawada R,Yamada T,Tsuchiya T,et al.A microarray analysis of the effects of serum free Medium on gene expression changes in human mesenchymal stem cell during the in vitro culture[J].Yakugaku Zasshi,2010,130(10):1387-1393.

41 Bernardo ME,Zaffaroni N,Novara F,et al.Human bone marrow derived mesenchymal stem cells do not undergo transformation after long term in vitro culture and do not exhibit telomere maintenance mechanisms[J].Cancer Res,2007,67(19):9142-9149.

42 杨顺良,谭建明.肾脏疾病的干细胞治疗[J/CD].中华细胞与干细胞移植(电子版),2009,2:138-146.