RP-HPLC法测定不同溶剂和缓冲溶液中羟基喜树碱的溶解度

蒲晓辉，孙 进，秦一萌，廉 鹤，何仲贵＊

（1.河南大学药学院 药物分析教研室，河南 开封475004；2.沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳110016）

羟基喜树碱（Hydroxycamptothecin，HCPT）是中国特有珙桐科旱莲属落叶植物喜树（Camptotheca acuminata）中含有的一种生物碱。上世纪六十年代，Wall等［1］首先从喜树中分离出具有抗肿瘤活性的喜树碱（Camptothecin，CPT）和 HCPT。20世纪70年代初期，CPT以水溶性钠盐的形式进入临床研究，对肝癌、胃癌、膀胱癌及白血病有较好的近期疗效，但因伴有严重的副作用（消化道反应，血尿，白细胞及血小板减少）使得Ⅱ期临床无法继续。1980年，Wall［2］在“喜树碱的结构和活性的关系”中，肯定了HCPT是所有天然存在或合成的CPT类似物中活性最高的，而毒性比CPT低。喜树碱类药物的抗肿瘤活性主要通过作用于Topo I，抑制DNA的复制和转录，进而使细胞出现程序性凋亡和死亡。癌细胞中Topo I含量比正常细胞高得多，Topo I更易受到抑制，从而可以达到杀死癌细胞的目的［3－6］。HCPT是一种由五个环组成的化合物，其中有一端为六元环内酯，此内脂环的20（S）比20（R）抗癌活性大10～100倍，但该内酯环遇碱不稳定，易水解开环，抗癌活性降低。HCPT没有明显的碱性，属于中性生物碱，不溶于酸，遇酸不易成盐，不溶于水，难溶于脂，微溶于无水乙醇、甲醇，可溶于碱、吡啶、二甲亚砜、氯仿－甲醇混合液等有机溶剂。

我们建立了适用于羟基喜树碱理化性质研究的高效液相分析方法，首次对羟基喜树碱在不同溶剂和不同pH值的磷酸盐缓冲溶液中的溶解度进行了考察，为羟基喜树碱新型制剂的处方设计、工艺研究和稳定性考察提供了参考。

1 试药与仪器

1.1 试药

羟基喜树碱（湖北黄石飞云制药，纯度＞99%）；甲醇（色谱纯，天津康科德化学试剂厂）；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

紫外分光光度仪（UV-1801，日本岛津公司）；高效液相色谱仪 （L-7000，日本Hitachi公司，带有自动进样器、紫外检测器）；电子分析天平（FA2104，上海精密科学仪器有限公司）；PHS-2C型精密酸度计（上海雷磁仪器厂）；HZQ-C空气浴振荡机（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；TGL-16B离心机（上海安亭科学仪器厂）；XW-80A涡旋混合器（上海精科实业有限公司）。

2 实验方法和结果

2.1 HCPT体外分析方法的建立和确证

2.1.1 检测波长的选择 取一定质量浓度的HCPT标准溶液（溶剂为甲醇），以甲醇作为空白对照，于200～400nm波长范围内扫描，结果见图1。由图可见，HCPT在266nm和384nm波长有最大吸收。为了避开末端吸收的影响，我们选择384nm作为检测波长。

2.1.2 色 谱 条 件［7－9］色 谱 柱：Diamonmsil-C18（4.6mm×200mm，5μm）；流动相：甲醇-0.1mol／L磷酸盐缓冲液（60∶40），pH＝5.0；检测波长：384nm；流速：1.0mL／min；柱温35℃；进样量：20μL。

图1 HCPT紫外扫描图

2.1.3 系统适用性实验 取一定质量浓度的HCPT标准溶液，以20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，见图2。实验结果表明，在“2.1.2”项的色谱条件下，HCPT峰拖尾因子为1.272，分离度＝2.024＞1.5，色谱柱理论塔板数按HCPT计算不少于3 000。

2.1.4 HCPT内酯型和羧酸盐型色谱峰分离 取一定质量浓度的HCPT标准溶液置25mL量瓶中，用pH6.0的磷酸盐缓冲溶液定容至刻度，取20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱峰，可见HCPT的内酯型和羧酸盐型的2种形式可以通过HPLC有效地分离，见图3。

图3 内脂环和羧酸盐形式的HPLC色谱图Ⅰ：羧酸盐；Ⅱ：内脂环。

2.1.5 标准曲线的制备 取HCPT原药2.53mg，精密称量，置100mL棕色量瓶中，用适量甲醇溶解并稀释定容至刻度，摇匀，得储备液。精密量取10mL储备液至25mL量瓶中，用适量甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为10.12mg／L的标准溶液。分别精密量取该标准溶液适量，置于10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得到0.050 6、0.101 2、0.202 4、0.506 0、1.012 0、2.024 0mg／L的标准系列溶液，分别吸取各标准溶液20μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积。以HCPT质量浓度X（mg／L）为横坐标，峰面积Y为纵坐标进行线性回归，得HCPT的线性回归方程为：Y＝9 583.7 X＋368.3，r2＝0.999 9。结果表明，在0.050 6～10.120 0mg／L范围内HCPT质量浓度和峰面积呈良好的线性相关性，标准曲线见图4。

图4 HCPT的标准曲线图

2.1.6 精密度实验 取质量浓度为1.012mg／L的HCPT标准溶液5份，分别在日内和日间重复测定，考察精密度，结果见表1。

表1 HCPT的精密度实验结果（n＝5）

2.1.7 回收率实验 精密量取空白纳米混悬液1mL，加入HCPT储备液适量，用甲醇稀释至质量浓度分别为0.1、1、5mg／L，进样测定峰面积，按标准曲线计算回收率，结果见表2。

表2 HCPT的回收率实验结果（n＝5）

2.2 HCPT在不同溶剂中的平衡溶解度测定

根据不同制备工艺的要求，选择低毒性的有机溶剂作为溶剂，测定平衡溶解度。各种溶剂分别取2mL置于10mL具塞玻璃试管中，然后加入过量的HCPT，置水浴恒温振荡器中，在25℃、150次／min的条件下，振荡72h，离心，取上清液1mL，用适量的流动相稀释，以“2.1.2”项下的色谱条件，取各溶液20μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积［10］。由回归方程计算浓度，并求算HCPT的平衡溶解度，结果见表3。

2.3 HCPT在不同pH值缓冲溶液中的平衡溶解度

HCPT在其水溶液中以闭环的内酯和开环的羧酸盐2种形式共存，二者之间存在着一个pH值依赖的平衡关系，随着碱性的增强，闭环的内酯转向开环的羧酸盐，见图5。HCPT内酯形式在水中的溶解度远小于羧酸盐形式，因此，随着pH值的变化，2种形式在水中溶解度的总和也随着变化。这一性质不仅影响着制备工艺的选择，而且也影响到药物在胃肠道内的吸收和转运，进一步影响药物的疗效。所以，研究HCPT在不同pH值缓冲溶液中的平衡溶解度，可以为制备工艺的选择和处方设计提供依据。

表3 HCPT在不同溶剂中的平衡溶解度

图5 HCPT的内酯环和羧酸盐形式的互变方程式

取2mL不同pH值缓冲溶液各3份，置于10mL具塞玻璃试管中，然后加入过量的HCPT，置于水浴恒温振荡器中，在25℃、150次／min的条件下，振荡72h，然后经15 000r／min离心10min，上清液经0.1μm膜滤过，取续滤液0.5mL，用适量的体积分数为0.1%的醋酸甲醇溶液稀释，以“2.1.2”项下的色谱条件，取各溶液20μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积［10］。由回归方程计算质量浓度，进一步计算HCPT的平衡溶解度，结果见表4。

表4 HCPT在不同pH值缓冲溶液中的平衡溶解度

3 讨论

经绘制紫外可见吸收图谱，HCPT在266nm和384nm波长有最大吸收，且吸收强度接近。由于很多溶剂和辅料在200nm左右有明显吸收，从而形成末端吸收，因此，对最大吸收在200nm附近的药物的测定可能会产生干扰。为了避开末端吸收的影响，文中我们选择384nm作为检测波长，这与大多数文献报道［11－13］的结果相一致。

在含 量 测 定 中，曾 选 用 流 动 相［7－9，14－16］：乙 腈－75mmol／L醋酸铵缓冲液 （30∶70），含三乙胺5mmol／L，冰醋酸调pH 至6.4；乙腈－水（25∶75）；乙腈-75mmol／L醋酸铵缓冲溶液（25∶75），含三乙胺5mmol／L，冰醋酸调pH 至5.6；甲醇-0.1mol／L磷酸盐缓冲液（60∶40），调pH至5.0。结果表明，前3种流动相都使HCPT的色谱峰略有前延，且使HCPT的信号响应值变小，这可能是因为HCPT遇到偏碱性流动相会部分开环，使极性增加，保留时间变短，同时使峰面积变小，从而影响含量测定的准确度。

根据试验结果可知，HCPT在大多数有机溶剂和缓冲溶液中的平衡溶解度都很低，表明HCPT的水溶性和脂溶性均较差，这可归因于HCPT的高熔点、低logP值，此类物质属于砖灰型成分，分子间作用力强，结晶能高。而药物溶出过程中涉及的活化能是影响药物溶出的一个重要因素，对于结晶形式的药物，只有溶解能超过其活化能（即晶格能）时，药物才能溶出，因此，像HCPT这样的高熔点、低logP值的药物一般平衡溶解度低，属于不溶于水，难溶于脂类化合物。

HCPT的化学结构中存在1个羟基和1个内酯环，在其水溶液中以闭环的内酯和开环的羧酸盐2种形式共存。在强碱环境下，内酯环都可能开环转向羧酸盐形式，其平衡溶解度随着pH值的变化而变化。根据不同pH值缓冲溶液中的HCPT平衡溶解度的测定结果可知，HCPT的平衡溶解度基本上随着碱性的增强而提高，在pH 3.0时平衡溶解度最低，pH1.2时HCPT的平衡溶解度比pH 5.0、pH 6.0、pH 6.8时要高，从这一点我们可以推测，当HCPT在胃中达到饱和时，进入肠道后可能会因过饱和而沉淀析出［17］。所以，不同pH值缓冲溶液中的HCPT平衡溶解度的测定结果，为我们设计HCPT口服制剂的处方和工艺提供了有力的依据。

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