Notch1受体和配体分子Jagged1蛋白在肝癌组织中的表达及意义

刘 虹，李 建

（1.中南大学湘雅医院，湖南 长沙 410008；2.长沙市中心医院 B超室，湖南 长沙 410008）

Notch信号通路存在于许多动物体内，Notch信号通路作为一种进化保守的细胞间相互作用机制，影响细胞分化发育及凋亡。目前在脊椎动物中共发现4个同源体Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。其中Notch1不仅对正常细胞分化起重要作用，而且与一些肿瘤的发生发展相关。Notch1在肿瘤中有截然相反的两种作用，至于其是癌基因还是抑癌基因。目前尚存争议。Notch1信号通路是许多重要细胞信号传导通路的交汇点，对Notch1的研究可进一步阐明肿瘤的发生机制，为肿瘤的基因治疗及新药开发提供一个新的有希望的靶点。但是，目前尚未见国内外研究Notch1与肝癌中作用的报道少见。因此，本研究拟通过检测Notch1、Jagged1在肝癌组中的表达，初步探讨肝癌组织中Notch1、Jagged1的表达与肝癌细胞分化程度的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

材料来源于中南大学湘雅医院2010年1月～2011年1月经病理检查证实的肝癌样本150例和及其相应癌旁正常组织。其中，男98例，女52例，年龄32～72岁，中位年龄52岁。术前均未接受过非甾体类抗炎药治疗及放、化疗。标本取出后立即以10%中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，5μm连续切片备用。临床与病理证实均未发现转移，肿瘤分化程度根据Edmondson四级分级法.将HCC分为I、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级。

1.2 主要试剂

Notchl抗体（鼠抗人单克隆抗体，美国Neomarker公司，clone A6），工作浓度为 1∶50；Jagged1抗体（鼠抗人单克隆抗体，美国Santa-cruz公司，sc8303），工作浓度为1∶50，SP免疫组化试剂盒购自福建迈新生物技术有限公司。

1.3 方法

标本经10%中性甲醛液固定，常规处理，石蜡包埋，连续切片厚4μm。采用免疫组化SP法：石蜡切片脱蜡至水；3%H2O2室温孵育30min，以消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min；微波抗原修复；10%正常山羊血清封闭，室温孵育15min，倾去血清，分别滴加Notch1、Jagged1一抗工作液，4℃孵育过夜，PBS冲洗。5min×3次：滴加生物素标记的二抗，37℃孵育20～30min，PBS冲洗，5min×3次；滴加辣根酶标记链酶卵白素.37℃孵育 20～30min，PBS冲洗，5min×3 次；DAB显色；自来水充分冲洗、复染、封片。实验中同时设阳性和阴性对照。

1.4 染色结果判断

Notch1和Jagged1阳性染色定位于胞浆。参照CARCANGIU等[2]的半定量评分方法。根据阳性细胞着色程度和阳性细胞数量判断结果。细胞阳性着色程度按无色、淡棕黄色、棕黄色、棕褐色分别计为0、1、2、3 分，阳性细胞数量按 ＜5%、5%～35%、36%～70%、＞70%分别计为 0、1、2、3 分，然后根据两项评分相乘之积判断结果≤1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～5分为中度阳性（++），≥6分为强阳性（+++）。

1.5 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件包进行等级资料的秩和检验和等级相关分析。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 Notch1受体和配体分子Jagged1在肝癌和癌旁正常组织中的表达

免疫组化结果显示，肝癌组织中Notch1及Jagged1分子主要表达于肿瘤细胞的胞浆（附图）。由表1可见，Notch1受体分子和配体Jagged1分子在肝癌和癌旁正常组织中均有不同程度的表达，在肝癌和癌旁正常组织中，Notch1的阳性表达率分别为16.4%和 91.3%；Jagged1的阳性表达率分别为10.9%和85.7%，两组间差异均有显著性（P=0.000）。

表1 Notchl、Jaggedl蛋白在肝癌、癌旁正常肝组织中的表达

附图 Notch1和Jagged1免疫组化检测结果[通用型两步（400×）]

2.2 肝癌组织中Notch1、Jagged1蛋白的表达与临床病理特征的关系

2.2.1 肝癌组织中Notch1、Jagged1蛋白的表达与患者性别及年龄的关系

2.2.2 肝癌组织中Notch1、Jagged1蛋白的表达与病理特征的关系 表3可见，Notch1分子的表达与肝癌组织学分级、Edmondson分期及有无淋巴结转移均无关（P＞0.05）。表4可见，Jagged1分子在肝癌不同分化级别间差异显著，中高分化组肝癌Jagged1表达（82.9%）显著低于低分化组（100.0%，P＜0.05）；分化程度越低，Jagged1的表达越高，两者呈负相关（rs=-0.392，P=0.002）；不同 Edmondson 分期间Jagged1 表达差 异也显著 ，Edmondson（I+II）期Jagged1表达（78.3%）显著低于 Edmondson（III+IV）期（96.4%，P＜0.05）；从 Edmondson I期到 IV期，表达逐渐增高，两者呈正相关（rs=0.276，P=0.001）；有淋巴结转移者Jagged1的表达（97.1%）显著高于无淋巴结转移者（73.3%，P＜0.05），且两者之间也呈正相关（rs=0.252，P=0.006）。

表2 肝癌中Notch1及Jagged1蛋白表达与与患者性别、年龄及肿瘤大小之间的关系

表3 肝癌组织中Notch1和Jagged1蛋白表达与病理特征之间的关系

2.2.3 肝癌组织中Notch1与Jagged1的表达的关系由表4可见，肝癌组织中Notch1与Jagged1的表达呈正相关（rs=0.247，P=0.007）。

表4 肝癌组织中Notch1与Jagged1的表达的关系

3 讨论

Notch信号是细胞与细胞之间直接作用的主要信号通路之一，对多细胞生物中细胞命运的决定起关键作。在哺乳动物中共发现4类Notch基因，编码4种Notch受体，分别为Notchl1-4。Notch受体是一种跨膜受体，成熟的Notch受体分子是由胞外域和跨膜区/胞内域2个亚基组成的异三聚体。Notch胞外区与其配体结合后调节细胞间的相互作用并进而激活Notch，经3次裂解后产生NICDN，此为Notch受体的活化形式。

1991年，Notch1与肿瘤的关系首先在人类T淋巴母细胞白血病中被确定[1]随后的研究发现，染色体易位 t（7；9）（q34；q34.3） 使位于 9 号染色体上的Notch1基因断裂，导致Notch1胞外区丢失，其胞内区获得组成性活性而呈现致癌作用。但Notch信号与肿瘤的关系极其复杂，在不同状况下，分别充当癌基因或抑癌基因的作用。如TONON等[2]阐述了Notch在黏液表皮样癌中作为癌基因在信号通路中的作用，而NICOLAS等[3]则发现在鼠皮肤癌发生中，Notch1起抑癌作用而不是促癌作用。在不同组织、肿瘤发展的不同阶段，Notch的作用也可能不同。ZAGOURAS等[4]实验显示，从正常宫颈组织到宫颈上皮内瘤变，再到早期分化好的宫颈癌，Notch1的表达量逐渐增高，其定位由胞质至胞核，而晚期宫颈癌Notch1表达水平显著下降，提示Notch1在宫颈癌发生早期阶段为促癌作用，而晚期表现为抑癌作用。COLLINS等[5]研究发现，非小细胞肺癌（NSCLC）组织中Notch1和Notch2呈高表达，在小细胞肺癌（SCLC）中却很少能检测到Notch1表达，Notch2也只偶有表达。Notch1信号激活对NSCLC是促进肿瘤细胞生长，对SCLC则抑制肿瘤细胞生长。

人的Notch配体包括Delta1、Delta3、Delta4、Jaggedl和Jagged2五种。Jagged1是Notch受体的主要配体之一，参与调控许多组织的生长发育，对正常造血前体细胞的维持及其增殖的调控起着重要作用。Jagged1通过与邻近细胞表面Notch受体的胞外域结合而触发Notch信号通路，通过HES-1，Deltex和NF-κB等转录因子调节靶基因的转录。DICKSON等[6]发现乳腺癌组织中Notch1和Jagged1表达增强，并与恶性肿瘤侵袭性增强、预后不良有显著关系，其十年生存率及中位生存期明显降低。配体Jagged1蛋白的表达在转移性前列腺癌中的表达明显高于无转移者及前列腺良性组织，提示Jagged1与前列腺癌转移及复发有关。

本研究显示，Notch1蛋白在肝癌中的表达明显高于癌旁正常组织，与CHU等[7]的研究结果相符；本研究表明肝癌组织中Jagged1蛋白表达显著增强，且Notch1蛋白与Jagged1蛋白表达呈正相关。说明Notch1信号也参与了肝癌的致病过程。本研究还表明肝癌中Notch1及Jagged1蛋白的表达与患者性别与年龄，肿瘤的部位与大小均无关；但Jagged1蛋白的表达与大肠癌的分化程度有关，中高分化大肠癌Jagged1蛋白的表达显著低于低分化大肠癌，且两者呈负相关：不同Edmondson分期间Jagged1表达差异也显著，Jagged1 表达在 Edmondson（I+II）期患者中低于Edmondsons（III+IV）期，两者呈正相关；有淋巴结转移者Jagged1的表达高于无淋巴结转移者，也呈正相关关系。这些结果进一步提示Jagged1可能在肝癌的发生发展中起促进作用。因为肿瘤组织学分级、Edmondsons分期及淋巴结转移与预后密切相关。因此，肝癌组织中Jagged1蛋白的表达可能作为预测肝癌预后的一个指标，有待进一步随访研究。

综上所述，笔者发现：肝癌组织中Notch1受体及其相关配体Jagged1的蛋白表达明显增强，且后者与肝癌分化程度、Edmondson分期及淋巴结转移密切相关。提示Notch信号在肝癌致病过程中起促癌作用。Jagged1在促进肝癌发生发展中可能起重要作用。有待进一步进行体内和体外实验证实。

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[2]TONON G MODI S,WU L,et a1.t(1l,19Xq21,p13)translocation in mucoepidermoid carcinoma creates a novel fusion product that disrupts a Notch signaling pathway[J].Nat Genet,2003,33(2)：208-213.

[3]NICOLAS M,WOLFER A,RAJ K,et a1.Notch1 functions as a tumor suppressor in mouse skin[J].Nat Genet,2003,33(3)：416-421.

[4]ZAGOURAS P,STIFANI S,BLAUMUELLER CM,et a1.Alterations in Notch signaling in neoplastic lesions of the human cervix[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(14)：6414-6418.

[5]COLLINS BJ,KLEEBERGER W'BALL DW.Notch in lung development and lung cancer[J].Semin Cancer Biol,2004,14(5)：357-364.

[6]DICKSON BC,MULLIGAN AM,ZHANG H,et a1.High-level JAG 1 mRNA and protein predict poor outcome in breast cancer[J].Mod Pathol,2007,20(6)：685-693.

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