ELISA检测牛口蹄疫非结构蛋白抗体

2012-11-23索南卓玛

中国畜牧兽医文摘 2012年4期

索南卓玛

（青海省同德县畜牧兽医工作站，同德 813200）

口蹄疫病毒（FMDV）的衣壳是20面的对称体，由VP1、VP2、VP3和VP4共4种结构蛋白构成，除结构蛋白外，FMDV还有几种非结构蛋白，包括前导蛋白酶2A、2B、2C、3A、3B、3C蛋白酶和3D聚合酶及它们的前体（2种以上蛋白的复合体）。

采用疫苗的国家，大多数动物血清的FMDV结构蛋白和病毒感染相关抗原（VIAA既3D）抗体为阳性，因此，一些基于结构蛋白和病毒相关抗原的诊断方法，很难确定FMDV感染与否。目前，疫苗生产工艺在病毒纯化过程中去除了大部分的非结构蛋白。因此，用灭活苗免疫动物体内的抗体产生，而没有病毒非结构蛋白3ABC抗体产生，为此检测FNDV非结构蛋白3ABC抗体的酶联免疫吸附试验（ELISA），不但可以检测隐性感染动物，而且以区分感染动物和免疫动物，并能及时了解免疫动物的抗体水平，有效预防动物发生FMD，具有非常重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 3ABC基因表达蛋白包被ELISA板、洗板封闭、阴阳性对照、如果血清中有3ABC抗体，其即可与ELISA板上3ABC蛋白结合，形成抗原-抗体复合物，再与酶标二抗结合，加入底A、B、终止液。

1.1.2 疫苗采用牛口蹄疫灭活疫苗，由中国威特生物科技股份有限公司生产的，批号为D10112J。

1.1.3 试验动物选用青海省大通县引进的10头野血牦牛进行FDMV灭活疫苗肌肉注射，3ml/头，在首次免疫15 d后采取静脉血，制备血清，进行FDM抗体检测。

1.2 操作程序

1.2.1 对苯二甲酸丁二醇酯（PBST）用无离子水或蒸馏水做1∶25倍稀释。

1.2.2 待检血清样品和阴阳性对照血清用稀释液1∶21倍稀释，（120 μl血清稀释液加血清6 μl）每孔加入100μl阴阳对照血清样品平行加2孔，用封口膜封口，37℃结合30min。

1.2.3 取掉封口膜，每孔加满洗涤液，洗涤5次，最后一次拍干。

1.2.4 用血清稀释液按1∶100比例稀释酶标二抗，每孔加入100 μl，用封口膜37℃ 结合30 min。

1.2.5 取掉封口膜，每孔加满洗涤液洗涤5次，最后一次拍干。

1.2.6 将底物溶液A按1∶50比例稀释于底物溶液B（1ml底物B中加入20 μl底物 A）混匀，每孔加入100 μl，用封口膜封口，37℃避光作用不超过10 min。

1.2.7 每孔加入100 μl终止液，注意要按加酶标二抗的顺序加入终止液，应用酶标仪492nm波长测定吸光值（OD492值）。

2 结果判定

从图1可以看出，本试验通过10头接种FMD灭活疫苗15 d后采取的牛血清，其NSP-ELISA平均OD492nm值为0.3805，标准差为0.0685，临界值=0.3805+0.0685×3=0.5860。有8份血清OD492nm值超出临界值，表明该I-ELISA对灭活疫苗免疫牛的特异性为96%以上。

3 结论

酶联免疫吸附试验是通过化学和免疫学的方法，将酶标记在抗原或抗体上，使其保持免疫学生物活性，当酶结合物与相应的抗体或抗原发生反应时，就可形成既有免疫学活性又有酶活性的“抗原-抗体-酶”的复合物，然后加入相应的酶底物，借助酶崔化的作用，无色的底物发生水解，氧化或还原反应等，形成有色的或电子致密的不溶产物。因此，从上述计算中可以看到，牛注射（FMD）灭活疫苗15 d后，检测抗体效价存在与否。从血清非结构蛋白3ABC抗体的检测结果表明，本次试验建立的FMD-3ABC-I-ELISA不但存在免疫动物抗体的产生水平，而且对非结构蛋白中的3A、3B、3C自然感染抗体也具有重大的检测意义，这次检测的血清效价虽与之上述计算结果相吻合，有8份血清OD492nm值超临界值，疫苗免疫牛的特异在96%以上，但在操作过程中还是要注意冰冻血清的融化均匀程度，血清稀释液和底物平衡至室温的应用等，以保证准确，减少试验的误差。