奥氮平增加大鼠H9C2心肌细胞巨噬细胞迁移抑制因子基因和蛋白表达☆

邢梦娟 Dake Qi 张成芳 丁文华 江开达 马端 崔东红

第二代抗精神病药物（second generation antipsychotics，SGA）奥氮平是治疗各种精神疾病尤其是精神分裂症、双相情感障碍等最广泛的临床用药之一。在其表现出很强的抗精神病作用、较少神经系统副作用的同时，却引起代谢障碍的不良反应，如体重增加、胰岛素抵抗、糖尿病、心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）等［1，2］，而后者是精神分裂症患者死亡的主要原因［3］。临床［4］、队列［5］及流行病学研究［6］均提出SGA可以增加CVD风险，甚至引起致死性心脏病［7］，但具体的机制尚不清楚。MIF是第一个被发现的细胞因子，参与多种炎症反应，在心血管疾病中也发挥关键的作用［8］，甚至有学者提出 MIF在 CVD的发病中起直接作用［9］。Schober等［10］应用 MIF基因敲除小鼠的研究也指出MIF可能就是动脉粥样硬化的病因。然而抗精神病药物引起的心血管事件是否通过MIF通路尚无报道。本研究采用培养的大鼠心肌细胞来探索奥氮平是否影响大鼠H9C2心肌细胞MIF的表达，为探讨奥氮平诱导心血管疾病的机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 大鼠心肌细胞H9C2（H9C2细胞系，ATCC号CRL-1446上海中科院）

1.1.2 实验药品 奥氮平纯品（大连美仑）。奥氮平用DMSO溶解，加到不含血清的DMEM基础培养基中，分别配成含40、20和10 umol奥氮平的培养液，DMSO最终浓度不超过0.1%，对照培养液含相同浓度DMSO。

1.1.3 实验试剂 胎牛血清（Bioind），DMEM高糖培养基（Gibco），兔抗鼠单克隆 MIF 抗体（chemokine），兔抗鼠 GAPDH抗体（fermentas），羊抗兔 IgG-HRP（fermentas）、预染蛋白 marker（fermentas），Trizol试剂 （invitrogen），ECL发光盒 Pierce ECL Western Blotting Substrate （thermo），PrimeScript®RT reagent Kit（Takara），荧光染料 SYBR Green I（ABI）、引物由invitrogen公司合成（见表1）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 H9C2细胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养，培养于37℃、含5%CO2的培养箱中。

1.2.2 奥氮平处理 H9C2细胞用0.5%血清的培养基饥饿24 h，再加入不同浓度奥氮平培养液培养24 h，取变化最明显的浓度40 umol为固定浓度，将细胞培养 1、3、12和 24 h，所有实验设置未用奥氮平处理组为对照组（con），用Trizol收集细胞并放在－80℃冻存备用。

1.2.3 总 RNA的提取及逆转录合成 cDNA 氯仿－异丙醇法抽提总mRNA，用752紫外光栅分光光度计测定样本的总RNA纯度及浓度后样本保存于－80℃冰箱备用。按照逆转录试剂盒说明书操作步骤，合成第1链cDNA后冻存于－20℃中备用。

1.2.4 SYBR Green I荧光染料 RT-qPCR 定量检测 使用SYBR Green I荧光染料法在384孔ABI Prism 7900 序列检测系统（Applied Biosystems，CA）上荧光实时定量PCR扩增，分析MIF基因表达。为控制不同样本间的基因表达差异，用管家基因3－磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）作为内对照基因，来标化目的基因的表达（以GAPDH作为内对照基因，计算MIF基因mRNA相对定量即2－△△CT）。每个样本的MIF基因和内对照GAPDH基因均重复3次。荧光实时定量 PCR扩增体系共 10 μL：SYBR Green I PCRMastermix5μL，上、下游 Primer计0.8μL，RNasefree H2O 3.2 μL，cDNA 模板 1 μL。 荧光实时定量PCR 用 2步法，扩增条件：95℃ 10 min，95℃ 30s、60℃1 min、72℃1 min、40个循环。采用比较循环数（cycle threshold，CT）的方法相对定量［15］。 荧光定量PCR的结果以CT值显示，CT值为每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。△CT值＝单样本平均目标基因CT值—单样本平均GAPDH基因CT值。以2－△△CT代表目的基因的表达水平（每个样本的△△CT＝每个样本的平均△CT一对照组的平均△CT）来计算表达差异的倍数。每次实验重复3次。

表1 用于RT-PCR及qRT-PCR的引物序列

1.2.5 蛋白印迹 冰上提取组织总蛋白，用BCA法测定蛋白质含量；用5X蛋白loading buffer（LB）将总蛋白配置成含1XLB的蛋白上样液，在100℃的block中煮沸5 min，室温下冷却后冻存于－80℃备用。配置12%的SDS-PAGE凝胶，用湿转法将蛋白电转到PVDF膜上；5%脱脂奶粉常温封闭1 h；加入 MIF、GAPDH 一抗（1 ∶2000，1 ∶5000），在 4℃冰箱中孵育过夜，TBST漂洗10 min×3次，加入二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG）室温孵育1 h，TBST漂洗10 min×3次，混均ECL显影液后在Fuji las3000显影仪中将免疫复合物显影。用计算机图像分析系统软件IMAGE J分析测定MIF及内参照GAPDH，比较MIF的积分光密度比值。

1.2.6 统计分析 应用 SPSS 17.0软件进行统计分析。数据用（）表示，采用独立样本t检验比较不同处理组与对照组间的差异；采用one-way ANOVA方差分析方法，以不同处理方式做为组间因素，比较不同处理对MIF表达趋势的影响，检验水准 ɑ＝0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 H9C2细胞用奥氮平处理后，MIF在mRNA水平表达升高 H9C2细胞用奥氮平在不同浓度处理（F ＝ 12.197，P ＝ 0.002）和不同时间处理（F ＝93.038，P ＜ 0.01） 后，MIF mRNA 的表达呈显著升高的变化趋势。用不同浓度的奥氮平处理H9C2细胞24 h，MIF的mRNA表达水平随着奥氮平处理浓度的增加而升高；在奥氮平浓度为40 umol时，MIF表达量最高（P＜0.01）；当固定奥氮平处理浓度时（40 umol），MIF的mRNA表达也随着处理时间的延长呈递增趋势，在处理时间为24 h时，MIF的表达增加最显著（P＜0.01）。奥氮平诱导H9C2细胞MIF的mRNA表达水平升高，这种升高与奥氮平的浓度及处理时间存在依赖关系（见图1）。

图1 H9C2细胞用奥氮平处理后MIF mRNA表达改变

2.2 H9C2细胞用奥氮平处理后，MIF在蛋白水平表达升高 H9C2细胞用奥氮平在不同浓度处理（F ＝ 10.713，P ＝ 0.004）和不同时间处理（F ＝56.708，P ＜ 0.01）后，MIF 蛋白的表达呈显著升高的变化趋势（见图2）。用奥氮平处理H9C2细胞24小时，MIF蛋白表达水平随着奥氮平处理浓度的增加而增加，在浓度为40 umol时，MIF在蛋白的表达水平最高（P ＜ 0.01，见表 2）；当固定奥氮平处理浓度时为40 umol时，随着处理时间的延长，MIF的蛋白表达也逐渐增加，在处理时间为24 h时，MIF的蛋白表达增加最显著（P ＜ 0.01，见表 2）。奥氮平处理诱导H9C2细胞的MIF在蛋白表达水平升高，这种升高与奥氮平处理存在浓度与时间的依赖关系。

图2 H9C2细胞用奥氮平处理后MIF蛋白表达改变

表2 蛋白印迹的MIF的积分光密度比值 （）

表2 蛋白印迹的MIF的积分光密度比值 （）

1）：与对照组相比，经单因素方差分析方法检验，P＜0.052）：与对照组相比，经单因素方差分析方法检验，P＜0.01

组别按浓度分组按处理时间分组10 umol 20 umol 40 umol 1 h 3 h 12 h 24 h n3333333 MIF的积分光密度比值1.16 ± 0.141.36 ± 0.181）1.50 ± 0.132）1.13 ± 0.081.39 ± 0.981.55 ± 0.951）1.98 ± 0.122）

3 讨论

奥氮平的抗精神病作用确切，神经系统副作用较少，临床应用日益广泛，由于部分患者用药出现的代谢紊乱及CVD风险，严重影响了患者对该药的依从性，制约了其临床使用。临床研究显示精神分裂症患者较正常人的预期寿命缩短20%，而2／3以上的患者死于冠心病（正常人群为 1 ／2）［11］。一项包括18个研究的Meta分析表明CVD是精神分裂症患者的主要死亡原因［3］。临床也反复证实SGA可诱发严重的CVD。但SGA诱发CVD的机制目前尚不清楚。传统观点认为CVD是SGA诱发代谢障碍的后果，SGA通过拮抗中枢组胺、5-HT等神经递质增加代谢障碍易感性，加剧肥胖、糖尿病、高脂血症的发生，从而增加CVD的风险。然而，临床上有部分患者在没有代谢障碍的情况下仍然发生CVD，因此，还存在传统观点无法解释的SGA致CVD机制。

MIF作为一种多效的细胞因子，在免疫、炎症、代谢、损伤修复等病理生理过程中发挥重要作用。近年研究发现MIF在CVD中有重要作用，临床研究发现动脉粥样硬化、急性心肌梗死、冠心病等患者血清高MIF水平［12］；动物研究也发现MIF在动脉粥样硬化动物模型的血管平滑肌中也表达升高［13］。在MIF基因敲除的动物模型中不易诱发动脉粥样硬化，以上研究从多个层面揭示了MIF与CVD之间的联系。但其深层次的机制目前尚不清楚，目前MIF在心脏损伤中的作用结论相互矛盾，有研究认为MIF对心肌具有损伤作用，如在正常情况下，培养基中少量的MIF可以引起心肌调亡，MIF可能通过加速心肌的凋亡导致心衰［14］。MIF敲除小鼠炎症反应降低，从而减少了心肌缺血再灌注损伤［15］，提示MIF可能参与心肌缺血再灌注损伤。但也有研究认为MIF升高后活化磷酸腺苷激活蛋白激酶AMPK而对心肌细胞起保护作用［16］或通过减弱氧化应激反应来保护心脏缺血再灌注损伤［17］。

本研究发现，用奥氮平处理大鼠心肌细胞H9C2用后，MIF表达在mRNA与蛋白水平均升高，且MIF的表达变化与奥氮平处理的浓度和处理的时间存在数量依赖关系，提示奥氮平可以诱导心肌细胞分泌MIF，推测MIF在奥氮平诱发的CVD中可能发挥调节作用，但作用机制尚有待进一步深入研究。因此，本研究存在一定的缺陷，本研究仅发现奥氮平处理心肌细胞后MIF表达升高这一现象，推测MIF可能参与奥氮平诱导的心肌损伤。而MIF升高在奥氮平诱导CVD中起何种作用、机制如何尚未研究。此外，细胞研究是一个独立微观水平的研究，其结果能否在动物水平及人体水平研究中重现，仍需进一步的研究证实。虽然本研究尚存在以上不足，但发现奥氮平在心肌细胞模型上可以诱导MIF的高表达，据我们所知，目前尚无这方面的报道，本研究结果为今后深入研究奥氮平诱导的CVD的机制提供了部分依据。

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