木霉菌株TC-14的生物学特性及rDNA ITS序列测定

邓 龙 邓 勋 尹大川 宋瑞清*

(1.黑龙江省林科院，哈尔滨 150081；2.东北林业大学 林学院，哈尔滨 150040)

木霉菌(Trichodermaspp.)广泛存在于土壤及其他基质中，生长迅速且具有极强的环境适应能力[1]。木霉菌是世界著名的生防菌，其生防机理包括竞争作用、重寄生作用、代谢抑菌活性物质、细胞壁降解酶以及诱导植物抗性等多个方面[2]。化学防治带来的一系列环境问题日益突出，生物防治技术正日益受到重视，目前世界范围内已经形成多个商品化木霉菌剂产品[3]，在农业、林业中的土传病害、叶部病害的生物防治中发挥了重要的作用。

木霉菌株TC-14是经筛选获得的高效生防菌株。前期试验结果表明，该菌株对林木主要病原菌包括立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、樟子松枯梢病菌(Sphaeropsissapinea)、杨树烂皮病菌(Cytosporachrysosperma)、松烂皮病菌(Cenangiumferruginosum)等具有较强的拮抗作用，其代谢产物可以有效抑制病原菌菌丝的生长。在野外应用研究中，利用木霉菌株TC-14制作的菌剂对林业苗圃的针叶苗木立枯病具有较好的生物防治效果。为进一步大规模的发酵和菌剂生产的需要，本文系统地研究了菌株TC-14的生物学特性，同时对其rDNA ITS序列进行了测定，通过分子生物学手段验证其分类学地位。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

木霉菌株TC-14为经室内外筛选获得的高效菌株，保存于东北林业大学森林微生物研究中心。

1.2 试验方法

1.2.1 木霉菌株TC-14的生物学特性

(1)温度对菌株生长的影响。菌丝测定实验采用生长速率法(以下同)。用直径10mm的打孔器切取培养好的菌落，接种于PDA平板培养基中心，分别置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的恒温箱中培养，48h后测量菌落直径，每个梯度设3个重复。

(2)碳源对菌株生长的影响。供试培养基为碳源培养基(配方：各种碳源20g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3g，琼脂20g，水1 000mL，pH值为6.0)。供试碳源为甘露醇、蔗糖、乳糖、半乳糖、葡萄糖、淀粉、麦芽糖。以PDA培养基上的培养作为对照。25℃恒温培养。方法同上。

(3)氮源对菌株生长的影响。供试培养基为氮源培养基(配方：各种氮源2g，葡萄糖20g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3g，琼脂20g，水1 000mL，pH值为6.0)。供试氮源为甘氨酸、硝酸钙、蛋白胨、酵母膏、硫酸铵、酒石酸铵、硝酸铵。以PDA培养基上的培养作为对照。方法同上。

(4)pH值对菌株生长的影响。将培养基pH值调为5、6、7、8、9。用直径10mm的无菌打孔器切取已培养好的木霉菌落，接种于不同pH值平板培养基(所用培养基为PDA培养基)中心，25℃恒温培养。48h测量菌落直径，每个处理设3个重复。

1.2.2 木霉菌株TC-14 rDNA ITS序列测定

采用CTAB法[4]提取菌丝体DNA，应用ITS1和ITS4引物[5]进行PCR扩增(ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，引物由上海生工生物公司合成。

PCR反应体系：10X PCR buffer 5μL，dNTPS 5μL，ITS1引物5μL，ITS4引物5μL，Taq酶0.75μL，DNA模板2.5μL，ddH2O 26.75μL，总体积50μL。

PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸2min，30个循环，72℃补平10min。

将未纯化PCR产物直接测序，对测序结果在GenBank中核酸数据库序列进行Blast分析，确定其分类地位，使用MEGA4.0软件，采用UPGMA法对ITS区域(ITS1+5.8S+ITS2)构建系统进化树，进行亲缘关系和系统发育分析[6]。

2 结果与分析

2.1 木霉菌株TC-14的生物学特性

(1)温度对菌株生长的影响。菌株TC-14在试验所设温度范围内均可生长(图1)。25℃生长最好，生长2d菌落长满平板。菌落生长速度较快，菌丝较为旺盛；10℃生长极其缓慢，且菌落形态较为稀疏。生长的最佳温度范围是25～30℃。

(2)碳源对菌株生长的影响。木霉菌TC-14能够利用的碳源比较广泛，对供试碳源均有较高的利用率(图2)。其中，对葡萄糖、乳糖和蔗糖利用最好，菌株在以葡萄糖、乳糖和蔗糖作为碳源的培养基上生长2d，菌落直径超过55mm。利用较差的是甘露醇。

(3)氮源对菌株生长的影响。木霉菌株TC-14能较好的利用各种有机氮源和无机氮源(图3)。在供试氮源中，利用最佳的氮源是酒石酸铵和蛋白胨，在以酒石酸铵为氮源的培养基上培养2d菌落直径达到56.1mm，利用最差的氮源是硝酸钙。

(4)pH值对菌株生长的影响。木霉菌株TC-14在不同的pH值梯度范围均可生长(图4)。在pH值为7的培养基上生长最为旺盛，菌丝生长速率最快，且致密。培养2d菌落直径达到62.5mm。随着pH值的增加，菌株生长呈下降趋势，在pH值为9的培养基中，菌丝生长缓慢，稀疏，说明木霉菌株TC-14不宜在偏碱性的环境中生长。

2.2 木霉菌株TC-14 rDNA ITS序列测定

使用引物ITS1和ITS4从木霉菌株TC-14扩增出的目的片段为582bp(图5，图6)，GenBank登陆号为HQ845040。

1 ggggcaatcg actcactcca acccaatgtg aacgttacca aactgttgcc tcggcgggat

61 ctctgccccg ggtgcgtcgc agccccggac caaggcgccc gccggaggac caacctaaaa

121 ctcttattgt ataccccctc gcgggttttt ttataatctg agcctttctc ggcgcctctc

181 gtaggcgttt cgaaaatgaa tcaaaacttt caacaacgga tctcttggtt ctggcatcga

241 tgaagaacgc agcgaaatgc gataagtaat gtgaattgca gaattcagtg aatcatcgaa

301 tctttgaacg cacattgcgc ccgccagtat tctggcgggc atgcctgtcc gagcgtcatt

361 tcaaccctcg aacccctccg gggggtcggc gttggggatc ggccctccct tagcgggtgg

421 ccgtctccga aatacagtgg cggtctcgcc gcagcctctc ctgcgcagta gtttgcacac

481 tcgcatcggg agcgcggcgc gtccacagcc gttaaacacc caacttctga aatgttgacc

541 tcggatcagg taggaatacc cgctgaactt aagcatatca aa

图6木霉菌株TC-14rDNAITS序列

从GenBank核酸序列数据库进行比对，获得相似率较高、亲缘关系近的物种，采用UPGMA法对ITS区域(ITS1+5.8S+ITS2)构建系统进化树(图7)。从聚类结果可以看出，该种内存在一定的遗传分化，主要分化为2个类群(种)。类群(种)1包括4个菌种，其中Hypocrealixii-FJ517546、H.lixii-FR872740、H.lixii-JN179079和T.haziranum-TC-14相似率高于98%，聚成一支，验证为哈茨木霉(Trichodermaharzianum)，其有性型为Hypocrealixii。

3 结论

(1)木霉菌株TC-14最适宜的碳源为葡萄糖，最适宜的氮源为蛋白胨，最适宜培养温度为25℃，适宜在偏酸性环境下生长。

(3)试验菌株为哈茨木霉(Trichodermaharzianum)。rDNA ITS序列长度为582bp，GenBank登陆号为HQ845040。

参考文献：

[1]王斌.长枝木霉TlCC鉴定及其生物学特性研究[J].中国农学通报，2011,27(5):338～345.

[2]朱廷恒，邢小平，孙顺娣.木霉T97菌株对几种植物病原真菌的拮抗作用机制和温室防治试验[J].植物保护学报，2004,31(2)：139～144.

[3]Mausam V., Satinder K. Antagonistic fungi, Trichoderma spp.: Panoply of biological control[J].Biochemical Engineering Journal,2007，(37)：1～20.

[4]周玲玲，梁俊峰.大型真菌DNA提取方法的改进[J].广东林业科技，2011,27(1)：13～16.

[5]White T J, Bruns T, Lee S, et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M].Academic Press,1990:315～322.

[6]郭春宣，王峰，董爱荣.粗毛纤孔菌形态学鉴定及ITS序列系统发育分析[J].中国农学通报，2010，26(3)：142～145.