Hemin诱导大鼠肝脏HO-1表达对非酒精性脂肪性肝炎的保护作用

赵 丽， 赵曙光， 张 蓉， 闻勤生

(第四军医大学唐都医院消化内科， 西安 710038;*通讯作者，E-mail:wenqsss@yahoo.com.cn)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化和肝癌，是临床常见的慢性肝病。NASH是NAFLD的一种类型，是由单纯性脂肪肝发展至肝纤维化、肝硬化甚至肝癌的关键转折点［1］。然而，NASH发病机制复杂，至今尚未完全阐明，目前公认的“二次打击”学说认为氧化物和抗氧化剂之间失衡造成的氧化应激及大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)氧化不饱和脂质引起的脂质过氧化均可导致NASH的发生及发展。其中，氧化应激为单纯性脂肪肝进展为NASH的始动环节。近年来研究显示血红素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)对氧化应激所致的肝细胞损伤有保护作用［2］。脂肪变肝细胞的抗氧化防御能力较正常肝细胞显著降低，HO-1的外源性调节可能有助于减轻脂肪性肝损伤，延缓或阻止NASH的进展。本实验通过高脂饮食建立大鼠NASH模型，用HO-1诱导剂氯化血红素(hemin)进行干预，观察上调HO-1表达对肝脏氧化应激及肝功能相关指标的影响，探讨HO-1对NASH的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 Hemin购自南京建成生物有限公司;牛胆盐、胆固醇均购自北京奥博星生物技术责任有限公司;丙二醛(malondialdehyde，MDA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)试剂盒均购自南京建成生物有限公司;兔抗HO-1多克隆抗体购自美国Abzoom公司;羊抗兔IgG抗体(二抗)购自北京博奥森公司。

1.2 动物及分组 清洁级SD雄性大鼠24只，12周龄，体重(200±30)g，由第四军医大学实验动物中心提供。适应性喂养1周后随机分为对照组，模型组和hemin干预组，每组8只。对照组给予普通饲料，模型组及干预组给予髙脂饮食共8周。之后对照组继续普通饲料喂养，模型组继续髙脂饮食喂养，干预组给予髙脂饮食加每日hemin 15 mg/kg腹腔注射，共10 d。第10天处死大鼠，进行相关指标的检测。

1.3 大鼠NASH模型建立 参考钟岚等［3］方法配成高脂饲料(在普通饲料基础上加10%猪油、2%胆固醇及0.5%牛胆盐)。共喂养8周。

1.4 观察指标方法

1.4.1 肝组织病理学检测 肝脏右叶留取部分组织，浸泡于10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察。

1.4.2 肝功能检测 大鼠心脏内取血，常规分离血清，用全自动生化分析仪检测ALT、AST的变化。

1.4.3 GSH和MDA的检测 大鼠血浆，按照试剂盒说明分别用紫外分光光度法在不同波长下测定GSH、MAD水平。

1.4.4 Western blot检测肝脏 HO-1的表达 取蛋白样品经10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳90 min，再以65 v转膜2 h将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上。取出转移膜置于封闭液中，室温、摇床上缓慢摇动状态下封闭1 h。滴加抗HO-1一抗(1∶1 000)4℃过夜，过夜后复温至室温，TBST缓冲液反复洗膜10 min×3次。将二抗用1×TBST稀释3 000倍，将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中(室温、避光缓慢摇动)作用60 min，用1×TBST洗膜，方法同上，洗去游离二抗。在暗室中向膜滴加发光液，室温作用4 min，曝光完成后将膜用PBST洗10 min，用膜再生液洗涤30 min，再用PBST洗3×10 min，将膜封闭后GelDoc凝胶成像仪采集图像。

2 结果

2.1 病理学变化 对照组大鼠肝脏无明显肿大，外观色泽呈红褐色，无明显异常;模型组大鼠肝脏明显肿大，外观色泽黄腻，偶可见局部白色变性灶，边缘圆钝，切面油腻;hemin干预组肝脏色泽、质地、体积较模型组均有所改善。光镜下观察，对照组大鼠肝组织结构完整、清晰，肝小叶结构正常，肝细胞排列成肝索，在中央静脉周围呈放射状分布，细胞呈多边形;模型组大鼠部分肝细胞内可见脂滴聚积，见少量炎细胞浸润，多位于汇管区，以淋巴细胞为主;hemin干预组脂肪变性及炎症表现均轻于模型组(见图1，见237页)。

图1 各组大鼠肝脏病理学改变Fig 1 The pathological changes in rat liver tissues of different groups

2.2 血清 ALT、AST、MDA、GSH 变化 模型组ALT、AST、MDA 较对照组显著升高(P＜0.01)，hemin干预组ALT、AST、MDA较模型组显著降低(P＜0.01)，但干预组水平仍高对照组(P＜0.01);模型组GSH较对照组显著降低(P＜0.01)，hemin干预组GSH较模型组显著升高(P＜0.01)，但干预组仍低于对照组(P＜0.01，见表1)。

表1 各组血清AST、ALT、MDA和GSH水平比较(±s)Tab 1 Comparison of serum AST，ALT，MDA and GSH among different groups(±s)

表1 各组血清AST、ALT、MDA和GSH水平比较(±s)Tab 1 Comparison of serum AST，ALT，MDA and GSH among different groups(±s)

与对照组比较，#P＜0.01;与模型组比较，*P＜0.01

干预组 182.75±12.98#* 65.13±8.63#* 6.42±0.68#* 17.95±3.64#*

2.3 肝脏HO-1表达的变化 Western blot检测各组大鼠肝脏HO-1表达，结果显示正常对照组大鼠肝脏组织中HO-1仅少量表达，模型组大鼠肝脏组织中HO-1的表达轻度增加，Hemin干预组大鼠肝脏组织中HO-1的表达较对照组及模型组均明显增加(见图2)。

图2 Western blot检测各组大鼠肝脏HO-1的表达Fig 2 The expression of HO-1 by Western-blot in rat livers

3 讨论

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的发病率呈逐年上升趋势，与高血压、高血脂、2型糖尿病等并列成为代谢综合征的重要组成部分。NAFLD包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化和肝癌，是临床常见的慢性肝病。NASH是NAFLD发病过程向更严重疾病发展的关键转折点［4］。有关NASH的发病机制以Day等［5］的“二次打击”理论最为普遍。初次打击是指在胰岛素抵抗及继发的高胰岛素血症基础上，出现大量游离脂肪酸(FFA)输入肝脏导致肝脏脂质沉积。第二次打击为过量的FFA沉积诱发氧化应激，进一步引起脂质过氧化产生大量活性氧，ROS的增加刺激单核巨噬细胞、枯否细胞和肝细胞等凋亡增加并异常释放炎性细胞因子，引起生物膜反应，导致线粒体肿胀、变性及通透性增加，肝细胞变性、坏死、炎性细胞浸润和纤维化形成，从而产生脂肪性肝炎。其中，氧化应激为单纯性脂肪肝进展为NASH的始动环节。

对HO-1的研究已有几十年的历史，以往认为HO-1的作用是催化血红素在机体内氧化降解，维持血红素代谢平衡，近年来认为其在氧化应激中具有重要作用［6］。HO-1是胆红素形成过程中的第一种酶，也是一种限速酶，它在NADPH、细胞色素P450还原酶和氧存在的情况下能氧化血红素生成一分子胆绿素，一分子一氧化碳以及一分子铁离子［7］，随后胆绿素在胆绿素还原酶作用下生成胆红素，所产生的胆绿素及胆红素具有较维生素E更强的抗氧化作用，在体内对氧化损伤有明显的保护作用，对抗氧化应激而保护细胞［8］。HO-1活性的增高可促进运铁蛋白的合成，通过增加细胞内铁的流出而具有细胞保护作用［9］。近年来许多动物实验证明，诱导HO-1表达有助于机体对氧化应激和缺血再灌注损伤的保护。

本实验中，采用hemin大鼠腹腔注射方法，观察其对大鼠肝脏HO-1的诱导表达作用。hemin既是HO-1的底物，又是HO-1的促进剂，能诱导HO-1基因表达。肝组织学检查结果显示hemin干预组大鼠肝组织较模型组脂肪变性及炎症表现明显减轻。Western blot检测模型组HO-1表达较正常组稍增加，hemin干预组大鼠肝脏HO-1表达较正常组及模型组明显增加。MDA作为脂质过氧化产物之一，可以反映体内脂质过氧化的程度。GSH的活性成分为还原型谷胱甘肽，参与体内氧化还原过程同时还可对抗自由基对重要脏器的损害，保护细胞膜中含巯基的蛋白质和含巯基酶不被破坏，同时还可对抗自由基对重要脏器的损害。两者均反映机体氧化损伤程度。AST、ALT均反映肝脏组织受损程度。实验结果显示模型组MDA、AST、ALT明显较对照组增加，干预组介于两者之间。模型组GSH较对照组降低，干预组介于两者之间。实验结果表明hemin能诱导HO-1的表达并减轻髙脂饮食引起的肝脏氧化应激水平，从而起到对NASH保护作用。

本实验发现hemin诱导大鼠肝脏HO-1的表达，对大鼠NASH有保护作用。其机制可能与诱导HO-1表达能够减轻髙脂饮食引起的肝脏组织氧化应激水平，从而改善肝脏组织学及肝功能改变。此实验结果为以HO-1为靶点进行NASH防治提供新的实验基础及理论依据。

［1］Ludwig J，Viggiano TR，McGill DB，etal.Nonalcoholic steatohepatitis:Mayo Clinic experienceswith a hitherto unnamed disease［J］.Mayo Clin Proc，1980，55(7):434－438.

［2］Babu AN，Damle SS，Moore EE，etal.Hemoglobin based oxygen carrier induces hepatic heme oxygenase 1 expression in Kupffer cells［J］.Surgery，2007，1 42(2):289－294.

［3］钟岚，范建高，王国良，等.非酒精性脂肪性肝炎动物模型的建立［J］.中华实用医学，2000，2(1):3－6.

［4］Zou Y，Li J.High-fat emulsion-induced rat model of nonalcoholic steatohepatitis［J］.Life Sci，2006，79(11):1100－1107.

［5］Day CP，James OF.Steatohepatitis:a tale of two“hits”［J］?Gastroenterology，1998，114(4):842－845.

［6］Pae HO，Oh GS，Choi BM，etal.Carbon monoxide produced by heme oxygenase-1 suppresses T cell proliferation via inhibition of IL-2 production［J］.J Immunol，2004，172(8):4744－4751.

［7］Otterbein LE，ChoI AM.Heme oxygenase:colors of defense against cellular stress［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2000，279(6):1029－1037.

［8］Kim YS，Zhuang H，Koehler RC，etal.Distinct protective mechanisms of HO-1 and HO-2 against hydroperoxide-induced cytotoxicity［J］.Free Radic Biol Med，2005，38(1):85－92.

［9］赵武述.免疫平衡研究及其临床意义［M］.北京:科学出版社，2005:90.